Система обнаружения ДНК-вирусов на основе RPA-CRISPR/Cas12a-SPM и глубокого обучения
10 мая 2024 г.
Мы представляем протокол, который сочетает амплификацию рекомбиназной полимеразы с системой CRISPR/Cas12a для обнаружения следов ДНК-вирусов и создает портативную микроскопию смартфона с классификацией с помощью искусственного интеллекта для обнаружения ДНК-вирусов в месте оказания медицинской помощи.
Наш протокол представляет собой быструю и высокочувствительную систему обнаружения вируса лягушки 3. Важно отметить, что этот метод позволяет обнаруживать ДНК-вирусы на месте оказания медицинской помощи, играя решающую роль в предотвращении возникновения пандемических заболеваний. Основное преимущество этого метода заключается в интеграции RPA с системой CRISPR/Cas12a, дополненной портативным микроскопом на основе смартфона и классификацией ИИ.
Такая интеграция значительно повышает эффективность и точность обнаружения при одновременном снижении количества ошибок, связанных с человеческим фактором. Для начала добавьте четыре ключевых фермента RPA в реакционный буфер. Затем добавьте в смесь заранее разработанные грунтовки.
Тщательно перемешайте смесь. Добавьте один микролитр целевой ДНК, полученной из вируса лягушки 3, в каждую реакцию RPA и хорошо перемешайте. Затем пипеткой нанесите семь микролитров 100 миллимолярного хлорида магния, чтобы начать реакцию.
Инкубируйте смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут, чтобы завершить анализ. Подготовьте белок бактерии Lachnospiraceae CAS12a с CRISPR RNA для образования функциональных комплексов. Смешайте бактериальный белок и 10 реакционных буферов CRISPR/Cas12a.
Теперь добавьте 500 наномолярных одноцепочечных репортерных зондов ДНК. Добавьте один микролитр продукта реакции RPA в реакционную смесь CRISPR/Cas12a CRISPR RNA. Инкубируйте смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.
Измерьте флуоресцентные сигналы с помощью считывателя микропланшетов. Для детектирования с помощью микроскопа смартфона сначала пипеткой нанесите приготовленную реакционную смесь на отступившее предметное стекло. Затем накройте его покровным стеклом перед инкубацией.
Поместите предметное стекло на предметный столик микроскопа смартфона и отрегулируйте фокусное расстояние и четкость. Захват изображения для измерения флуоресцентных сигналов. Используйте ImageJ для измерения среднего значения серого для каждого изображения и стандартного отклонения среднего значения серого для группы концентраций.
Примите модель глубокого обучения AlexNet 33 для классификации. Теперь используйте Python, чтобы изменить форму входных изображений до 224 на 224 по трем каналам. Наконец, используйте предварительно обученную магистральную сеть с набором данных ImageNet для извлечения объектов изображения.
Шестая пара капсюлей обеспечивала максимальную эффективность усиления и была выбрана. CRISPR RNA-3 оказался наиболее эффективным для коллатерального расщепления. Использование разработанной системы детектирования с выбранными праймерами RPA и CRISPR RNA привело к значимым различиям между 10 aM FV3 и контролем.
Наиболее важным моментом, о котором следует помнить, является конкретный шаг обнаружения CAS 12a. CRISPR РНК реакции может быть модифицирована или перепроектирована для нацеливания на другие ДНК-вирусы на основе обнаружения CAS 12a. Предложенный метод может помочь в предварительной оценке количества целевого вируса.
Исходя из этого, для получения более точной вирусной нагрузки можно использовать другие методы, такие как количественная ПЦР. Этот метод обеспечивает предварительную попытку портативного обнаружения ДНК-вирусов. Что касается вируса лягушки 3, используемого в этом протоколе, своевременное обнаружение может подтолкнуть к эффективным защитным мерам, снижающим потери в племенной отрасли.
Обзор
В данной работе представлена система быстрого и чувствительного обнаружения вируса лягушек 3 (frog virus 3), основанная на интеграции рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA) с системой CRISPR/Cas12a для обеспечения диагностики ДНК-содержащих вирусов непосредственно в месте оказания медицинской помощи. Этот инновационный метод направлен на повышение точности и эффективности детекции, что имеет решающее значение для предотвращения потенциальных пандемических вспышек.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Молекулярная биология
- Детекция патогенов
- Диагностика по месту оказания медицинской помощи
Теоретическая часть
- Значимость быстрого обнаружения вирусов в предотвращении пандемий.
- Интеграция передовых методик, таких как RPA и технология CRISPR.
- Роль портативных систем в проведении диагностических исследований в полевых условиях.
Используемые методы
- Рекомбиназная полимеразная амплификация (RPA)
- Система CRISPR/Cas12a
- Микроскопия на базе смартфона с классификацией с помощью ИИ
Основные результаты
- Значимое различие между образцами с 10 aM FV3 и контрольными образцами.
- Повышенная точность детекции за счет использования специфических праймеров и CRISPR-РНК.
- Возможность адаптации метода для других ДНК-содержащих вирусов путем модификации CRISPR-РНК.
Выводы
- В исследовании продемонстрирован эффективный портативный метод детекции ДНК-вирусов.
- Данный подход актуален для своевременного принятия защитных мер в животноводстве, что подчеркивает его важность для биологических исследований и общественного здравоохранения.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Системы быстрого портативного обнаружения ДНК-вирусов имеют решающее значение для раннего вмешательства и локализации инфекции как в исследовательских, так и в прикладных биофармацевтических условиях. Интеграция RPA-CRISPR/Cas12a с микроскопией на базе смартфона и глубоким обучением обеспечивает чувствительную, последовательность-специфичную детекцию непосредственно в месте оказания медицинской помощи, снижая зависимость от централизованных лабораторий. Такой подход способствует ускоренному принятию решений и снижению рисков на этапах открытий и трансляционных исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Обеспечивает быстрый анализ мишеней вирусной ДНК для снижения механических рисков.
- Поддерживает функциональную валидацию реагентов детекции и направляющих РНК CRISPR.
- Облегчает предварительный отбор перспективных систем детекции для дальнейшего развития портфеля разработок.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированный количественный анализ для оптимизации и валидации метода.
- Позволяет реализовать воспроизводимые и масштабируемые рабочие процессы детекции, подходящие для высокопроизводительного скрининга.
- Обеспечивает надежное сравнение эффективности праймеров и CRISPR-РНК для доработки метода.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует стратегиям разработки трансляционных биомаркеров, обеспечивая возможность выявления вирусов в полевых условиях.
- Обеспечивает преемственность этапов от открытия до доклинической валидации за счет получения количественных результатов с помощью портативных устройств.
- Снижает биологические риски, позволяя своевременно выявлять инфекцию и проводить вмешательство на соответствующих моделях.
Интеграция в пайплайны и рабочие процессы
Эта система связывает ранние этапы поиска, разработку анализов и трансляционные исследования, предоставляя портативную платформу для количественного детектирования, адаптируемую к нескольким ДНК-содержащим вирусам.
- Открытия в биологии: поддерживает проверку гипотез и валидацию мишеней посредством последовательность-специфичной детекции.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные показатели флуоресценции для стандартизации анализа.
- Аналитика: интегрирует классификацию на основе глубокого обучения для объективной и высокоточной интерпретации результатов.
- Трансляционные исследования: обеспечивает возможность быстрого применения детекции в полевых условиях для поддержки доклинических исследований и анализа биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: предлагает модульную платформу, адаптируемую к новым вирусным мишеням путем перепроектирования направляющих РНК CRISPR.
Влияние на операционную деятельность и предприятие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неоднозначность при обнаружении вирусов.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов детектирования.
- Стратегическая ценность: ускоряет принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и снижает биологические риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию с учетом рисков и способствует быстрому развитию технологий детектирования.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области молекулярной биологии и разработки CRISPR-анализов.
- Необходим доступ к портативным устройствам визуализации и вычислительной инфраструктуре для анализа с помощью ИИ.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов анализа и интерпретации данных.
- Метод может быть адаптирован для различных ДНК-содержащих вирусов путем изменения последовательностей CRISPR-РНК.
- Требуется предварительная валидация перед применением в различных полевых условиях.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:40
Combining Recombinase Polymerase Amplification (RPA) and CRISPR/Cas12a Systems for the Detection of DNA Viruses
1:20
CRISPR/Cas12a Detection With/Without Smartphone Microscopy (SPM)
2:23
Data Augmentation and Transfer Learning
2:58
Results: AI-Detection of DNA Virus Using RPA-CRISPR/Cas12a-SPM
3:26
Conclusion
