AMEBaS: Автоматическое выделение срединной линии и вычитание фона ратиометрических флуоресцентных таймлапсов поляризованных одиночных ячеек
23 июня 2023 г.
Современные методы анализа внутриклеточной динамики поляризованных одиночных клеток часто являются ручными и не стандартизированы. В этой рукописи представлен новый конвейер анализа изображений для автоматизации срединного извлечения одиночных поляризованных ячеек и количественной оценки пространственно-временного поведения по временным интервалам в удобном онлайн-интерфейсе.
Этот метод количественно оценивает пространственно-временную динамику поляризованных клеток вдоль их срединной линии, экспрессирующей флуоресцентный репортер или краситель для конкретного интересующего объекта, такого как актин, ионы или динамика везикул. Версия автоматизации устраняет предвзятость и обеспечивает масштабируемость, особенно для задач, которые выполняются вручную в цифровом виде и могут стать трудоемкими и субъективными. Для начала откройте Jupyter Notebook и прочтите файлы интервальной съемки, перейдя на домашнюю страницу интерактивной записной книжки Google CoLab или загрузив и открыв AMEBaS_local IP YNB с GitHub.
Чтобы подготовить настройку каталога для входных и выходных данных с использованием локальной версии, поместите таймлапс флуоресценции в виде файла TIF или DV в папку с именем data, расположенную в корневой папке программы. Создайте исходящую папку для получения сгенерированных данных, а затем запустите блок кода установки. Если вы используете блокнот в Google CoLab, выполните блок кода настройки для автоматического создания данных и исходящих папок, затем запустите блок кода ввода файла для чтения данных интервальной съемки, нажав кнопку воспроизведения.
Если вы используете Google CoLab, загрузите файл интервальной съемки в папку данных, нажав кнопку выбора файла. Затем выберите создание дополнительных выходных данных для каждого шага, задав для параметра verbose значение true или false. Чтобы отличить основную ячейку и сегмент от фона, запустите блок кода сегментации одной ячейки, нажав кнопку воспроизведения, чтобы автоматически отделить интересующую ячейку от фона.
Отрегулируйте значение sigma в переменной sigma, чтобы точно настроить сглаживание маски сегментации. Значение по умолчанию — 2.0. Теперь установите переменную estimate в false, чтобы сохранить порог, оцененный непосредственно из данных ISO, или true для сглаживания по соседним кадрам с помощью локальной полиномиальной регрессии.
Отрегулируйте переменную n_points для точной настройки функции со значением по умолчанию 40. Чтобы трассировать срединную линию вдоль расширения ячейки, запустите блок кода трассировки средней линии ячейки, нажав кнопку воспроизведения, чтобы скелетизировать ячейку по методу Ли и удлинить кончик последнего скелета с помощью линейной экстраполяции. Затем выберите параметр трассировки для средней линии, настроив аргумент complete_skeletonization для трассировки либо по последнему кадру, либо один раз за кадр.
Настройте переменную interpolation_fraction, чтобы задать долю точек в скелете для интерполяции во время экстраполяции. Значение по умолчанию здесь равно 0,25. Затем измените переменную extrapolation_length, чтобы определить длину экстраполяции средней линии.
Значение по умолчанию равно минус единице, что удлиняет скелет до ближайшего ребра. Теперь запустите первый блок кода визуализации данных, нажав кнопку воспроизведения, чтобы автоматически создать кимограммы для обоих каналов. Выберите размер гауссова ядра для сглаживания, настроив переменную kymograph_kernel.
Для правильного отображения интенсивностей непротяженных скелетов необходима пользовательская цветовая карта для их кимографов с шапками. Настройте переменную shift_fraction, чтобы выбрать долю процента интенсивности, которая будет обозначена в качестве цвета фона (черный). Затем запустите второй блок кода визуализации данных, нажав кнопку воспроизведения, чтобы автоматически сгенерировать кимограф метрики соотношения и интервальную съемку.
Настройте переменную switch_ratio, чтобы изменить порядок каналов, используемых в качестве числителя и знаменателя во время вычисления соотношения, по умолчанию — false. Проверьте, требуется ли дополнительное сглаживание коэффициента с помощью медианного фильтра, настроив переменную smooth_ratio. По умолчанию установлено значение false.
Затем выберите удаление или сохранение выбросов, возникающих в результате низкого сигнала в канале знаменателя, настроив переменную reject_outliers. Выбросы помечаются как значения, в 1,5 раза превышающие межквартильный размах выше третьего квартиля. Наконец, выберите, нужно ли экспортировать выходные данные фона и метрики соотношения, настроив переменную background_ratio.
Значение по умолчанию — false, чтобы заменить фон нулями. AMEBaS, протестированный на наборах данных, таких как пыльцевые трубки, экспрессирующие кальций-репортер камелеон, пыльцевые трубки, экспрессирующие индикатор рН флорин, корневые волоски, экспрессирующие кальциевый репортер NESYC 3.6, успешно работал, несмотря на различия в направлении роста, методах визуализации, флуоресцентных репортерах и типах клеток. Не забудьте выполнить набор блоков, чтобы вы могли установить необходимые пакеты.
Кроме того, очень важно настроить сигма-значения специально для ваших изображений, чтобы вы могли получить более точные результаты. Полученные кимограммы затем могут быть использованы для анализа пространственно-временной динамики решаемого вопроса. Кроме того, вы можете рассчитать его, найдя метод, рост и временные ряды, чтобы проанализировать правильное решение.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Этот манускрипт представляет новый конвейер анализа изображений, разработанный для автоматизации извлечения средней линии изображений поляризованных одиночных клеток и количественной оценки их пространственно-временного поведения. Удобный онлайн-интерфейс улучшает анализ данных тайм-лапс, устраняя ограничения ручных методов.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Клеточная динамика
- Анализ изображений
- Флуоресцентное имагинг
Бэкграунд
- Существующие методы анализа поляризованных клеток часто являются ручными.
- Ручной анализ может внести искажения и занимает много времени.
- Автоматизация в анализе изображений может улучшить масштабируемость и стандартизацию.
- Это исследование фокусируется на новом подходе к упрощению этого процесса.
Цель исследования
- Автоматизировать извлечение средней линии в поляризованных клетках.
- Количественно оценить пространственно-временную динамику из данных тайм-лапс имэйджинга.
- Предоставить удобный интерфейс для исследователей.
Используемые методы
- Использование Jupyter Notebook для анализа данных.
- Доступ к файлам тайм-лапс через Google CoLab или локальную установку.
- Подготовка входных и выходных директорий для управления данными.
- Выполнение кодовых блоков настройки и ввода файлов для обработки данных.
Основные результаты
- Метод эффективно количественно оценивает динамику поляризованных клеток.
- Автоматизация уменьшает субъективные искажения в анализе.
- Масштабируемость позволяет эффективно обрабатывать большие наборы данных.
- Результаты могут быть визуализированы и интерпретированы через интерфейс.
Выводы
- Предложенный конвейер улучшает анализ динамических свойств поляризованных клеток.
- Он предлагает стандартизированный подход к анализу изображений.
- Этот метод может значительно улучшить эффективность исследований в клеточных исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Automated midline extraction and background subtraction for ratiometric fluorescence time-lapse imaging addresses a critical bottleneck in quantifying spatiotemporal dynamics of polarized single cells. By eliminating manual tracing and arbitrary background correction, AMEBaS enhances predictive confidence and reproducibility in early discovery and target validation workflows. This capability supports robust, scalable analysis of intracellular signaling and morphological dynamics relevant to cell polarity and disease mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables unbiased quantification of intracellular dynamics along the cell midline for hypothesis-driven studies.
- Reduces operator bias and subjectivity in spatial analysis of cell polarity markers.
- Supports mechanistic de-risking by providing standardized, quantitative outputs for pathway interrogation.
- Facilitates portfolio triage by enabling comparative analysis across cell types and experimental conditions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, reproducible kymographs and ratiometric profiles for downstream screening workflows.
- Standardizes background subtraction and midline tracing, improving assay reproducibility and scalability.
- Enables high-throughput, quantitative evaluation of compound effects on polarized cell dynamics.
- Supports platform reuse across diverse fluorescent reporters and imaging modalities.
Translational & Preclinical Research
- Aligns quantitative imaging outputs with disease-relevant models of cell polarity and migration.
- Provides continuity from discovery imaging to preclinical validation of cellular phenotypes.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust, quantitative cellular readouts.
- Supports translational biomarker development by quantifying dynamic cellular processes.
Pipeline & Workflow Integration
AMEBaS integrates into the discovery-to-preclinical continuum by automating quantitative imaging analysis for polarized single cells, supporting workflows from early hypothesis testing to lead identification and translational research.
- Discovery Biology: Automates hypothesis testing and pathway clarification by extracting unbiased spatiotemporal profiles.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative kymographs and ratiometric outputs for assay development.
- Analytics: Provides standardized measurements and statistical outputs for cross-condition comparisons.
- Translational Research: Bridges discovery imaging with preclinical model validation for disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable computational pipeline adaptable to multiple cell types and imaging platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell polarity studies.
- Operational Value: Standardizes and scales quantitative imaging analysis across teams and projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust, unbiased data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs targeting cell polarity mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence imaging and computational analysis for optimal parameter adjustment.
- Needs access to Jupyter Notebook or Google CoLab environments and compatible imaging file formats.
- Demands cross-team standardization of imaging protocols and data management practices.
- Adaptable to various cell types, fluorescent reporters, and imaging modalities with parameter tuning.
- Dependent on image quality and appropriate segmentation for accurate midline extraction and quantification.
