Метод 3D-культивирования сфероидов клеточных линий эмбриональных и печеночных рыбок данио-рерио
20 января 2023 г.
Здесь мы представляем эффективный, простой и быстрый протокол 3D-культивирования для формирования сфероидов двух клеточных линий рыбок данио-рерио (Danio rerio): ZEM2S (эмбрион) и ZFL (нормальный гепатоцит).
Этот протокол может легко генерировать сфероиды рыбок данио, 3D-модель in vitro с различным потенциальным применением в тестировании токсичности рыб. Это простой и быстрый метод получения одиночных сфероидов клеточных линий рыбок данио, очень похожих по размеру и форме. Если правильно выполнить все описанные шаги, проблем возникнуть не должно.
Сфероиды рыбок данио-рерио могут принести большую пользу механизму изучения воздействия химических веществ на рыбу, что помогает улучшить оценку экологической безопасности таких продуктов, как косметика. Продемонстрирует процедуру Ирисдорис Родригес де Соуза, доктор генетики из моей лаборатории. Для начала возьмите колбу T75 с клетками рыбок данио-рерио при слиянии около 80%.
Удалите всю среду и промойте клетки, добавив 0,01 моляра PBS в колбу для культуры с помощью пипетки. Промойте колбу с культурой с помощью PBS, осторожно встряхнув колбу, а затем снимите PBS. Добавьте три миллилитра трипсина 0,5 миллимоляра ЭДТА в колбу для культуры и выдерживайте при 28 градусах Цельсия в течение трех минут.
Для отсоединения ячеек от колбы аккуратно постучите по колбе, чтобы освободить ячейки. А затем остановить переваривание трипсина, добавив в колбу три миллилитра полной питательной среды. С помощью пипетки перенесите клеточную суспензию в коническую центрифужную трубку объемом 15 миллилитров и центрифугу при 100 G в течение пяти минут.
Затем аккуратно удалите надосадочную жидкость. Добавьте один миллилитр полной среды для соответствующей используемой клеточной линии и ресуспендируйте гранулу с помощью микропипетки. Добавьте 10 микролитров клеточной суспензии и 10 микролитров красителя Trypan blue в микропробирку, чтобы подсчитать клетки и оценить их жизнеспособность.
Смешайте клеточную суспензию и краситель с помощью пипетки и перенесите 10 микролитров этой смеси в камеру Нойбауэра. Подсчитайте клетки в четырех больших квадратах или квадрантах, расположенных по углам камеры, считая клетки, которые не принимают трипановый синий, жизнеспособными. Затем рассчитайте количество жизнеспособных ячеек, используя уравнение, показанное на экране.
Умножьте этот номер ячейки на два, чтобы вычислить окончательный номер ячейки в суспензии клеток. После расчета количества ячеек отрегулируйте суспензию ячеек на пластину 200 микролитров этой суспензии на лунку 96-луночной пластины ULA с круглым дном с количеством ячеек, необходимым для каждой клеточной линии. Приготовьте суспензию с отрегулированной концентрацией клеток в среднем резервуаре и перемешайте с помощью многоканальной микропипетки без образования пены или пузырьков.
Добавьте 200 микролитров суспензии отрегулированной ячейки в каждую лунку круглой нижней пластины ULA. с помощью многоканальной пипетки. Пластина должна быть запечатана парапленкой или клейкой герметизирующей пленкой, чтобы избежать испарения питательной среды из 96-луночной пластины.
Инкубируйте пластину на орбитальном шейкере при 70 об/мин в течение пяти дней в инкубаторе с температурой 28 градусов по Цельсию без углекислого газа. Через пять дней наблюдайте за сфероидами под микроскопом с инвертированным светом, чтобы оценить сгенерированные сфероиды. Чтобы измерить их форму и размер, получить изображения сфероидов и использовать программное обеспечение для обработки и анализа изображений.
После настройки программного обеспечения для измерения выбранной области на основе известного масштаба выберите внешнюю сторону сфероида, чтобы определить его площадь и круглость. Площадь сфероида используется для определения его размера путем вычисления диаметра d, а программное обеспечение обеспечивает цикличность сфероида по формуле, в которой используются выбранные площадь и периметр. Клеточный агрегат ZFL образуется в первые сутки орбитального встряхивания.
Клеточный агрегат увеличивает свою цикличность на третий день и достигает адекватной сфероидальной формы на пятый день. Здесь показан 16-дневный сфероид ZFL в пластине ULA. Клеточная линия ZEM2S образует сфероиды с первого дня орбитального встряхивания.
Сфероид сохраняет свою форму и увеличивается в размерах на третий день, а его максимальная округлость достигается на пятый день. Здесь показан 10-дневный сфероид ZEM2S в пластине ULA. На этом рисунке показан измеренный размер сфероидов клеточных линий ZFL и ZEM2S и измеренный индекс цикличности сфероидов ZFL и ZEM2S.
На этом графическом изображении показана картина роста сфероидов ZFL и ZEM2S. Здесь показаны сфероид ZFL и сфероид ZEM2S, образовавшиеся после пяти дней орбитального трясения при 100 об/мин. На рисунке представлена картина роста и индекс цикличности сфероидов, образующихся при скоростях вращения 70 и 100 об/мин.
70 об/мин является наиболее адекватной скоростью для формирования сфероидов ZFL и ZEM2S этим методом. Окрашивание клеточных мембран лектином Alexa Fluor 594 и ядер DAPI демонстрирует клеточную целостность в ядре сфероидов. Флуоресценция резоруфина, образованного восстановлением AlamarBlue, демонстрирует жизнеспособные клетки в ядре обоих сфероидов.
Показан анализ жизнеспособности МТТ в 3D-культуре и 2D-культуре клеточной линии ZEM2S и ZFL, не демонстрирующий существенных различий. При выполнении этой процедуры убедитесь, что вы запечатали пластины, чтобы избежать изменения pH питательных сред и испарения в лунках. Сфероиды могут применяться в различных анализах in vitro для оценки токсических эффектов в печени рыб или в исследованиях развития с использованием клеточной линии эмбриона ZEM2S.
Этот протокол может помочь продвинуть вперед разработку теста на рыбу in vitro, способствуя прогрессу исследований экотоксичности без животных.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен простой и эффективный протокол создания 3D-сфероидов из клеток данио-рерио с использованием двух клеточных линий: ZEM2S и ZFL. Метод разработан с учетом простоты использования и быстроты выполнения, что делает его подходящим для различных целей при тестировании токсичности веществ на рыбах.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Токсикология
Теоретические основы
- Рыбки-зебра часто используются в биологических исследованиях благодаря прозрачности их эмбрионов и быстрому развитию.
- Сфероиды служат трехмерной моделью in vitro, которая близко имитирует условия in vivo.
- Понимание химического воздействия на рыб имеет решающее значение для оценки экологической безопасности.
- Данный протокол направлен на оптимизацию процесса формирования сфероидов для исследовательских целей.
Цель исследования
- Разработать быстрый и эффективный метод создания сфероидов из клеток zebrafish.
- Облегчить исследование воздействия химических веществ на рыб.
- Совершенствовать методологию тестирования токсичности веществ на рыбах.
Используемые методы
- Использование флаконов T75 для культивирования клеток.
- Поддержание конфлюэнтности клеток на уровне примерно 80%.
- Следование пошаговому протоколу формирования сфероидов.
- Демонстрация экспертом по генетике для обеспечения наглядности.
Основные результаты
- Данный протокол позволяет успешно создавать однородные сфероиды из клеточных линий данио-рерио.
- Сфероиды имеют стабильный размер и форму, что делает их пригодными для экспериментального использования.
- Возможные области применения включают оценку химической токсичности в водных средах.
- Оптимизированный процесс сводит к минимуму сложности при формировании сфероидов.
Выводы
- Данный протокол 3D-культивирования эффективен для получения сфероидов из клеток zebrafish.
- Он открывает перспективы для совершенствования методик тестирования токсичности на рыбах.
- Будущие исследования могут использовать эту модель для оценки экологической безопасности.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Трехмерные (3D) культуры сфероидов данио-рерио представляют собой масштабируемую и воспроизводимую платформу in vitro для изучения механизмов экотоксичности и оценки безопасности соединений. Данный метод устраняет недостатки двухмерных (2D) культур, обеспечивая тканеподобную организацию клеток и функциональное долголетие, что повышает прогностическую достоверность при скрининге на ранних стадиях. Совместимость метода с высокопроизводительным анализом делает его ценным инструментом для сортировки портфеля препаратов и принятия обоснованных риском решений о дальнейшем продвижении в экологических и фармацевтических исследованиях и разработках.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет детально изучить механизмы воздействия соединений в релевантном для ткани 3D-контексте.
- Способствует снижению биологических рисков за счет воспроизведения клеточных функций, характерных для условий in vivo.
- Повышает прогностическую достоверность оценки взаимодействия с мишенью и анализа сигнальных путей.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение стандартизированных, воспроизводимых сфероидов, подходящих для высокопроизводительного скрининга соединений.
- Предоставляет количественные показатели, такие как размер, циркулярность и жизнеспособность сфероидов, для считывания результатов анализа.
- Снижает необходимость ручного вмешательства за счет создания однородных одиночных сфероидов в каждой лунке.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям биологии развития и моделям, релевантным конкретным заболеваниям, для целей трансляционной токсикологии.
- Обеспечивает преемственность от этапа раннего поиска до доклинической оценки безопасности в водной среде и в контексте окружающей среды.
- Поддерживает принятие решений с учетом рисков за счет предоставления надежных и масштабируемых данных in vitro.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод создания 3D-сфероидов интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, связывая ранние механистические исследования и высокопроизводительный скрининг для оценки воздействия соединений фармацевтического и экологического происхождения.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей в физиологически релевантной системе.
- Скрининг: обеспечивает готовность и воспроизводимость анализа для рабочих процессов по оценке соединений.
- Аналитика: позволяет проводить количественное измерение морфологии и жизнеспособности сфероидов для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: предоставляет платформу для согласования результатов in vitro с конечными точками in vivo в токсикологии.
- Корпоративное повторное использование: предлагает стандартизированный масштабируемый протокол, который можно адаптировать для различных классов соединений и исследовательских групп.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность при оценке токсичности.
- Операционная ценность: обеспечивает получение стандартизированных, воспроизводимых и масштабируемых 3D-культур для высокопроизводительных рабочих процессов.
- Стратегическая ценность: повышает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет снижения биологических рисков на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков и продвижению соединений с повышенной биологической релевантностью.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток и манипуляциями с 3D-сфероидами.
- Необходим доступ к планшетам с ультранизкой адгезией, орбитальным шейкерам и программному обеспечению для анализа изображений.
- Требуется стандартизация между группами для обеспечения воспроизводимости в многоцентровых исследованиях.
- Метод применим к различным клеточным линиям zebrafish и, при оптимизации протокола, потенциально к другим видам.
- Ограничения включают необходимость тщательной герметизации планшетов для предотвращения испарения и сдвигов pH.
