Выделение и очистка микрососудистых и макрососудистых эндотелиальных клеток из образцов, полученных из легких
3 февраля 2023 г.
Несмотря на сложную задачу, выделение эндотелиальных клеток легких имеет важное значение для исследований воспаления легких. В настоящем протоколе описана процедура выделения макрососудистых и микрососудистых эндотелиальных клеток с высоким выходом и высокой чистотой.
Этот протокол актуален для выделения эндотелиальных клеток из образцов тканей или очень маленьких кусочков кровеносных сосудов. Основным преимуществом этого метода является то, что он может быть воспроизведен в любой исследовательской лаборатории и позволяет получить хорошую чистоту эндотелиальных клеток даже из очень маленьких образцов. Начните подготовку образца паренхимы легких с промывки собранных образцов в 50-миллилитровой пробирке, содержащей PBS без хлорида кальция и хлорида магния или PBS минус минус.
Переложите образцы в стерильную чашку Петри и измельчите вручную на мелкие фрагменты размером около трех-четырех миллиметров с помощью хирургических ножниц. Для сегмента артерии вымойте собранные образцы в 50-миллилитровой пробирке, содержащей PBS минус минус, и перенесите ее в стерильную чашку Петри, не измельчая. Чтобы удалить большую часть остаточной крови, дайте две промывки PBS минус минус нарезанной кубиками паренхиме легкого или сегменту легочной артерии.
Затем поместите образцы в 15-миллилитровые пробирки и инкубируйте с пятью миллилитрами коллагеназы II типа в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Чтобы удалить крупные фрагменты, поместите стерильное ситечко размером в один миллиметр на верхнюю часть 50-миллилитровой сборной пробирки и вылейте все содержимое из 15-миллилитровой пробирки на сетчатое фильтр. Затем аккуратно помассируйте переваренную ткань шпателем, прежде чем промыть образец PBS минус минус до тех пор, пока пробирка для сбора не будет заполнена.
Чтобы удалить несосудистые эндотелиальные клетки, отфильтруйте отток, собранный из переваренных клеток, в свежую 50-миллилитровую пробирку с помощью клеточного сетчатого фильтра размером 70 микрометров. Затем, используя сетчатый фильтр размером с ячейку размером 40 микрометров, соберите отток в свежую 50-миллилитровую пробирку, помеченную как пробирка 1. Центрифугируют образцы при 30 г в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы осадить кластеры клеток.
Используйте стерильную пипетку для переноса надосадочной жидкости в свежую 50-миллилитровую пробирку, помеченную как пробирка 2. Суспендируйте гранулы в тубу 1 и заполните пробирку до 50 миллилитров PBS минус минус. Точно так же заполните тюбик 2 до 50 миллилитров PBS минус минус.
После этого центрифугируйте образцы при 300 г в течение пяти минут при комнатной температуре. Суспендируйте гранулы с двумя миллилитрами питательной среды и засейте суспензию в две отдельные лунки предварительно закодированной шестилуночной пластины. Было замечено, что часть обработанных клеточных агрегатов, включая гладкомышечные клетки или SMC и фибробласты, были связаны с длинными волокнами.
Кроме того, SMC представляли собой большинство синглетов, не относящихся к клеткам крови. Небольшие компактные скопления клеток диаметром не более 10-20 микрометров не содержали элементов, относимых к фрагментам стромальной ткани. Было получено около 70% чистых микрососудистых эндотелиальных клеток легких человека, или HLMVEC, одиночных клеток.
При получении чистых препаратов HLMVEC отсортированные клетки приобретали характерную эндотелиоподобную форму. Фокальная микроскопия показала, что почти 100% очищенных клеток жира окрашены положительно на антигены эндотелиальных клеток, а именно CD31 и более специфический фактор фон Виллебранда. Когда эти клетки были помещены в матригель, они генерировали канальцевые структуры и HUVEC, подтверждая их эндотелиальный фенотип.
Из-за короткого времени инкубации во время ферментативного пищеварения важно предварительно подогреть коллагеназу. И еще один момент заключается в том, что во время осаждения клеточных кластеров важно аккуратно удалить надосадочную жидкость, не задевая клеточные агрегаты в поддоне. Эта процедура основана на использовании центрифугирования и фильтрации и, следовательно, может дать новое понимание того, как разделять другие типы клеток на основе их характеристик, таких как размер и кластеризация.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен протокол выделения эндотелиальных клеток легких, который имеет ключевое значение для изучения воспалительных процессов в легких. Этот метод позволяет получать эндотелиальные клетки высокой степени чистоты как из макрососудов, так и из микрососудов.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Клеточная биология
- Биология сосудов
- Исследование воспаления легких
Теоретические основы
- Эндотелиальные клетки играют ключевую роль в воспалении легких.
- Методы изоляции могут различаться по эффективности и чистоте.
- Высокая воспроизводимость в лабораторных условиях имеет решающее значение для получения стабильных результатов.
Используемые методы
- Ферментативное расщепление с использованием коллагеназы II типа
- Микрососудистые эндотелиальные клетки легкого человека (HLMVEC)
- Методы центрифугирования и фильтрации
Основные результаты
- Был достигнут высокий выход очищенных HLMVEC, составивший примерно 70%.
- Очищенные клетки имели типичную морфологию эндотелия и давали положительное окрашивание на маркеры эндотелия.
- Данный метод позволяет изолировать чистые эндотелиальные клетки, что дает возможность получить ценные сведения о разделении клеток на основе их размера и кластеризации.
Выводы
- Данный протокол расширяет понимание биологии эндотелиальных клеток в исследованиях легких.
- Он представляет собой ценный инструмент для изучения механизмов воспаления легких и состояния сосудов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Надежное выделение макрососудистых и микрососудистых эндотелиальных клеток из легочной ткани позволяет разрабатывать релевантные моделям заболеваний системы и проводить механистическую оценку рисков на ранних этапах биофармацевтических исследований и разработок.&D. Доступ к высокочистым сайт-специфическим эндотелиальным клеткам повышает прогностическую достоверность исследований в области биологии сосудов и трансляционных исследований. Данная возможность позволяет восполнить пробелы в портфеле ресурсов в тех случаях, когда коммерческие источники клеток или биобанки оказываются недостаточными для исследований, специфичных для конкретного генотипа или заболевания.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках&D
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет исследовать функцию эндотелиальных клеток в контексте соответствующих заболеваний.
- Способствует снижению механистических рисков за счет предоставления чистых популяций клеток для анализа сигнальных путей.
- Облегчает валидацию мишеней, позволяя напрямую изучать специфические для конкретных участков фенотипы эндотелия.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение валидированных первичных клеток для надежной разработки методов анализа и скрининга соединений.
- Повышает воспроизводимость анализа за счет минимизации контаминации неэндотелиальными клетками.
- Позволяет проводить количественную оценку эндотелиальных ответов на терапевтические препараты-кандидаты.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит модели in vitro в соответствие с биологией сосудов человека, имеющей значение для изучения заболеваний.
- Поддерживает поиск трансляционных биомаркеров, обеспечивая возможность проведения исследований на первичных эндотелиальных клетках человека.
- Обеспечивает преемственность этапов от первичного обнаружения до доклинической валидации в исследованиях сосудистых и воспалительных заболеваний.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол изоляции применяется на стыке этапов первичного поиска и разработки доклинических моделей, что позволяет проводить последующий скрининг и трансляционные исследования.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает получение чистых эндотелиальных клеток для проверки гипотез и выяснения механизмов сигнальных путей.
- Скрининг: Предоставляет стандартизированные популяции клеток для воспроизводимых платформ анализа.
- Аналитика: Обеспечивает количественные показатели, такие как чистота, экспрессия маркеров и функциональное формирование трубок.
- Трансляционные исследования: Связывает результаты исследований in vitro с доклиническими моделями с использованием клеток, специфичных для конкретных заболеваний и генотипов.
- Повторное корпоративное использование: Предлагает воспроизводимый и масштабируемый метод, который можно адаптировать к различным задачам в области исследований сосудов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозов и снижает механистическую неопределенность в исследованиях сосудов.
- Операционная ценность: стандартизирует изоляцию клеток, улучшая воспроизводимость и масштабируемость между лабораториями.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать более обоснованные решения о целесообразности дальнейшей разработки за счет предоставления релевантных биологических моделей на ранних этапах процесса.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию с учетом рисков, восполняя дефицит доступности клеток, специфичных для конкретных заболеваний и генотипов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с тканями и методами культивирования клеток.
- Необходим доступ к базовому оборудованию для клеточной биологии, такому как центрифуги и стерильные рабочие зоны.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения стабильной чистоты и фенотипа клеток.
- Метод применим к различным источникам тканей, но может потребоваться оптимизация протокола для других органов.
- Короткое время ферментативного переваривания и осторожное обращение имеют решающее значение для жизнеспособности и чистоты клеток.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Sample Preparation and Enzymatic Digestion
1:47
Recovery of the Digested Cells and Removal of Non-Endothelial Cells (EC) by Filtration
2:32
Sedimentation of Cell Clusters and Cell Seeding
3:16
Results: Purification and Characterization of Freshly Isolated HLMVECs
4:30
Conclusion
