Культура 3D-органоидов кишечника поросенка из криоконсервированных эпителиальных крипт и создание клеточных монослоев

Наш протокол предоставляет инструменты для изучения эпителия кишечника свиньи для ветеринарных и биомедицинских исследований. Кишечные органоиды свиней могут быть использованы для изучения транспорта питательных веществ, барьерной функции и взаимодействия хозяина и микроба. Благодаря консервации эпителиальных крипт кишечника свиньи можно создать большой запас стволовых клеток, которые в дальнейшем могут быть использованы для культивирования органоидов в 3D или 2D монослоях.

Этот протокол подробно описан для тощей кишки, но его также можно использовать для других сегментов кишечника, таких как двенадцатиперстная кишка, подвздошная кишка и толстая кишка. Для начала быстро разморозьте флакон, содержащий 900 замороженных крипт, на водяной бане при температуре 37 градусов по Цельсию. Перелейте раствор крипты в коническую трубку объемом 15 миллилитров.

Центрифугу при 300 х г в течение пяти минут при комнатной температуре и удалите надосадочную жидкость. Добавьте 150 микролитров внеклеточного матрикса или ECM с охлажденным наконечником для получения конечной концентрации 150 крипт на 25 микролитров ECM. Пипетка вверх и вниз 10 раз для получения однородной суспензии крипт в ECM.

Засейте шесть лунок каплей 25 микролитров на лунку в предварительно разогретую тарелку на 48 лунок. Инкубировать в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа для полимеризации ECM. Добавляют 250 микролитров на лунку культуры среды комнатной температуры и выдерживают при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.

Меняйте питательную среду каждые два-три дня. Для прохождения 3D-органоидов, полученных из замороженных крипт, через 10 дней после посева удалите питательную среду и добавьте 250 микролитров предварительно разогретого PBS при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации замените PBS 250 микролитрами предварительно подогретого реагента для диссоциации ферментов, дополненного 10 микромолярным ингибитором породы при 37 градусах Цельсия в каждой лунке.

Отделите органоиды в ECM, соскабливая пипеткой P-1000, и осторожно гомогенизируйте, пипетируя пять раз. Инкубируйте в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа, прежде чем диссоциировать клетки, пипеткой вверх и вниз 10 раз. Добавьте 500 микролитров DMEMc в каждую лунку, содержащую диссоциированные ячейки, и вытащите до 12 лунок в 15-миллилитровую коническую трубку, содержащую три миллилитра холодного DMEMc.

Центрифуга при 500 x g в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в одном миллилитре холодного DMEMc. Посчитайте ячейки с разведением от одного до двух в трипановом синем с помощью счетчика клеток.

Центрифугируйте необходимый объем клеточного раствора, чтобы иметь 3000 живых клеток на купол. Ресуспендируйте гранулу с 17 микролитрами холодного DMEMc на 3000 живых клеток на льду. Отрегулируйте объем до необходимого количества скважин.

Медленно добавьте 33 микролитра холодного ECM на 3000 живых клеток. Отрегулируйте объем до необходимого количества лунок и гомогенизируйте, не образуя пузырьков. Затем увидеть лунки с 50 микролитрами суспензии ячейки ECM на лунку в предварительно разогретой 24-луночной пластине и инкубировать в течение 30 минут для полимеризации ECM.

Добавьте 500 микролитров питательной среды на лунку. Затем инкубируют и меняют питательную среду каждые два-три дня. Чтобы покрыть культуральную вставку, приготовьте раствор для покрытия, содержащий коллаген IV, разбавленный до 50 мкг на миллилитр в холодном PBS.

Добавьте 150 микролитров разбавленного раствора покрытия в каждую вставку для клеточной культуры и инкубируйте в течение ночи или в течение трех часов. Через пять дней после расщепления отделите органоиды с помощью ECM, соскоблив их пипеткой P-1000. Тщательно гомогенизируют пипеткой в питательной среде и переносят в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую пять миллилитров холодного DMEMc на льду.

Центрифугируйте собранные органоиды при 500 х г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Тщательно аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре предварительно подогретого ферментного реагента диссоциации с добавлением 10-микромолярного ингибитора ROCK. Пипетка вверх и вниз 10 раз, чтобы инициировать диссоциацию органоидов.

Инкубируйте в течение пяти минут на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия для ферментативного пищеварения. Механически разрушают органоиды, пипетируя 10 раз и добавляя четыре миллилитра ледяного DMEMc. Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость перед ресуспендированием гранулы органоидной клетки в одном миллилитре DMEMc.

Подсчитайте ячейки в трипановом синем с помощью счетчика клеток и рассчитайте необходимый объем для посева 2,5 раза по 10 до пятых клеток на культурный вкладыш. Центрифугируют необходимый объем клеточной суспензии, соответствующий 2,5 раза 10 пятых клеток на культуральную вставку. Во время центрифугирования тщательно аспирируйте раствор покрытия из культуральных вкладышей и дайте ему высохнуть под колпаком без крышки в течение пяти минут.

После центрифугирования откажитесь от надосадочной жидкости и ресуспендируйте гранулу в необходимом объеме 2D-среды с добавлением 10-микромолярного ингибитора ROCK. Засейте 200 микролитров клеточной суспензии на проницаемую мембрану с покрытием. Добавьте 500 микролитров 2D-среды с добавлением 10-микромолярного ингибитора ROCK в нижний компартмент и инкубируйте.

На мембране должна наблюдаться высокая плотность клеток. Через день после посева замените эпическую и базальную среду свежей 2D-средой без ингибитора ROCK. Меняйте носители каждый день.

Монослой сливается через сутки после посева и может быть использован для его экспериментов. В этом исследовании эпителиальные крипты были получены из кишечника свиньи и криоконсервированы для длительного хранения в жидком азоте. После размораживания криптовые стволовые клетки были посеяны в ECM.

Органоиды наблюдались в течение трех-четырех дней и быстро росли и развивали почку. Примерно через 10 дней после оттаивания проводили пассаж органоидов для расширения культуры. Для оптимального поддержания культуры органоиды, используемые для упаковки, должны иметь четкий и пустой просвет и четко очерченные края без черного мусора в просвете, как это наблюдается у зрелых органоидов.

Клетки прикрепляются и образуют полностью сливающийся монослой в течение одного дня, что подтверждается высоким трансэпителиальным электрическим сопротивлением, или TEER, около 700 куполов квадратных сантиметров. TEER остается высоким в течение трех дней. Окрашивание актина указывает на то, что апикальная сторона эпителиальных клеток ориентирована на просвет в 3D-органоидах.

Органоидные клетки, посеянные в культуральные вставки, образуют сливающийся единый слой эпителиальных клеток с апикальной стороной, ориентированной к верхнему компартменту. Окрашивание окклюдином выявляет наличие плотных соединений на апикальной стороне эпителиальных клеток в 3D-органоидах и в клеточных монослоях. Важно помнить, что органоид, используемый для засева монослоев клеток, должен казаться прозрачным с пустым просветом без черного мусора, соответствующего скоплению мертвых клеток.

Монослои из органоида кишечника свиньи могут быть использованы для проверки влияния метаболитов или микробов на функцию эпителиального барьера с помощью функциональных анализов, визуализации и анализа экспрессии генов.