Одномолекулярная визуализация латеральной подвижности и активности ионных каналов в липидных бислоях с использованием флуоресцентной микроскопии с полным внутренним отражением (TIRF)

Ионные каналы не статичны в биологических мембранах. Здесь мы представляем оптический подход с одной молекулой, чтобы разгадать связь между диффузией боковой мембраны и функцией ионного канала. Основное преимущество этого метода перед другими методами заключается в том, что флуоресцентная маркировка белков, которая может мешать их боковому движению и функции, не требуется.

Метод может быть применен к любому мембранному белковому каналу, где свободная или ограниченная диффузия важна для организации и функционирования. Для начала перелейте 380 микролитров исходного раствора DPhPC в стеклянный флакон и наложите липидный исходный раствор аргоном или газообразным азотом, чтобы предотвратить окисление липидов. Используйте минимально возможный поток газа, чтобы избежать испарения органического растворителя, в котором растворены липиды, или разбрызгивания растворителя из флакона.

Высушите образец липидов под струей азота и удалите оставшийся органический растворитель из образца липидов под вакуумом с помощью безмасляного вакуумного насоса на ночь. Растворите липидную пленку в растворе гексадеканового силиконового масла, добавив равные объемы гексадекана и силиконового масла с помощью пипетки объемом один миллилитр до конечной концентрации липидов 9,5 миллиграмма на миллилитр. Поместите несколько стеклянных покровных листов в держатель из нержавеющей стали и очистите их в стеклянном стакане в течение примерно 10 минут с помощью ацетона в ультразвуковом очистителе.

Промойте покровные стекла двойной деионизированной водой и высушите их под струей азота. Далее очистите и гидрофилизируйте покровное стекло в плазменном очистителе с кислородом в течение пяти минут. Установите обработанное плазмой покровное стекло на спин-коутер и покройте покровное стекло пленкой агарозы толщиной субмикрон, медленно добавляя 140 микролитров нагретой 0,75%-ной легкоплавкой агарозы пипеткой объемом 200 микролитров при 3 000 об/мин в течение 30 секунд.

Немедленно прикрепите покровное стекло с покрытием тонким слоем гидрогеля агарозы к нижней стороне камеры из ПММА. Убедитесь, что гидрогель агарозы направлен вверх. Закрепите края покровного стекла на микрообработанном устройстве из ПММА прозрачной клейкой лентой и поместите устройство на горячую плиту, нагретую до 35 градусов Цельсия.

Осторожно налейте 200 микролитров 2,5%-ного раствора агарозы во входное отверстие камеры, не создавая пузырьков воздуха. Немедленно накройте лунки камеры ПММА примерно 60 микролитрами раствора липидного масла, чтобы инициировать образование липидного монослоя на границе раздела агарозного масла, чтобы избежать обезвоживания агарозы с спиновым покрытием в лунках камеры ПММА. Поместите устройство на горячую плиту при температуре 35 градусов Цельсия примерно на два часа.

Поместите около 20 микролитров раствора липидного гексадеканового силиконового масла в каждую из нескольких микрообработанных лунок в капельной инкубационной камере. Подготовьте иглу из микрокапиллярного стекла с диаметром отверстия наконечника около 20 микрометров с помощью вертикального или горизонтального съемника микропипетки. Заполните иглу примерно пятью микролитрами водного раствора для инъекций, содержащего 8,8 миллимоляра HEPES, семь микромоляров флуоресцентного красителя, Fluo-8, 400 микромолярных ЭДТА, 1,32 молярного хлорида калия и 30-наномолярный комплекс ядра TOM или, альтернативно, 20 наномолярных OMPF.

Установите иглу с водным раствором для впрыска на пьезоуправляемый наноинжектор и введите от 100 до 200 нанолитров водных капель в лунки в инкубационной камере капель, заполненной раствором липидного гексадеканового силиконового масла, с помощью наноинжектора. Позвольте образованию липидного монослоя на границе раздела капельного масла в течение примерно двух часов, поддерживая ПММА и камеры инкубации капель на горячей плите, нагретой до 35 градусов Цельсия. Вручную перенесите отдельные водные капли из лунок камеры капельной инкубации в лунки камеры ПММА с помощью одноканальной микролитровой пипетки с одноразовым полипропиленовым наконечником объемом 10 микролитров.

Позвольте каплям погрузиться на липидные монослои на границе раздела гидрогель-масло, образуя липидный бислой между каплями и агарозным гидрогелем. Установите камеру из ПММА с двухслойными мембранами с капельным интерфейсом или мембранами DIB на держателе образца микроскопа с инвертированным светом и оцените образование мембраны с помощью 10-кратного контрастного объектива модуляции Хоффмана. Если мембраны DIB сформировались, установите камеру из ПММА на держатель образца микроскопа TIRF, оснащенного обычным источником света для эпифлуоресцентного освещения, 488-нанометровым лазером и ПЗС-камерой с обратной подсветкой, умножающей электроны, для достижения размера пикселя около 0,16 микрометра.

Сфокусируйте край мембраны DIB с объективом с 10-кратным увеличением при эпифлуоресцентном освещении источником света высокой интенсивности с помощью набора фильтров GFP. Точная фокусировка на том же крае мембраны DIB при большом увеличении с помощью 100-кратного объектива NA 1.49 с апохроматическим маслом TIRF, опять же при эпифлуоресцентном освещении с источником света высокой интенсивности с использованием набора фильтров GFP. Измените настройку фильтра с GFP на четырехдиапазонный набор фильтров TIRF, включите 488-нанометровый лазер и установите интенсивность лазера на линзе объектива.

Чтобы визуализировать одиночные ионные каналы, отрегулируйте угол TIRF и усиление электромагнитной ПЗС-камеры таким образом, чтобы открытые ионные каналы в мембране DIB выглядели как высококонтрастные флуоресцентные пятна на темном фоне, а отношение сигнала к фону достигало максимума. Убедитесь, что пятна, соответствующие потоку ионов кальция через одиночные ионные каналы, остаются в фокусе и имеют круглую форму с высокой интенсивностью в центре и постепенно уменьшаются к периферии. Убедитесь, что флуоресцентные пятна находятся в фокусе, чтобы убедиться, что ионные каналы восстановились в мембранах DIB и движутся в боковом направлении в плоскости мембраны.

Наконец, запишите серию изображений мембраны, которая позволяет правильно отслеживать положение и контролировать открытое-закрытое состояние отдельных ионных каналов. Чтобы определить тип боковой подвижности и состояние активности канала, приобретают достаточно протяженные и хорошо отобранные траектории. Криоэм структура Neurospora crassa TOM-CC показана здесь.

Митохондрии из пятна N.crassa, содержащего TOM 22 с меткой 6-His, растворяли в DDM и подвергали никелевой аффинной хроматографии NTA и анионообменной хроматографии. SDS-PAGE изолированной кристаллической структуры TOM-CC и SDS-PAGE очищенной E.coli OMPF, использованные для сравнения, показаны здесь. Флуоресцентный амплитудный след на соответствующей траектории TOM-CC указывает на то, что активность TOM-CC в открытом-закрытом канале коррелирует с подвижностью латеральной мембраны комплекса.

Трассировка амплитуды отображает три состояния проницаемости: полностью открытое состояние, соответствующее движущимся каналам, промежуточное состояние проницаемости и состояние замкнутого канала, соответствующее неподвижным каналам. TOM-CC в промежуточном состоянии колеблется вокруг своего среднего положения примерно на плюс/минус 60 нанометров. Здесь показан след амплитуды флуоресценции на соответствующей траектории ОМПФ.

OMPF показывает только один уровень интенсивности по сравнению с TOM-CC, независимо от того, находится ли он в движении или в ловушке. Сегменты траектории, соответствующие временным периодам захваченных молекул, отмечены серым цветом. Важно отметить, что этот метод анализирует одномембранные белки в неповрежденной мембранной среде.

Динамика мембранных белков в обозримом будущем останется горизонтом для научных исследований. Мы ожидаем, что наш метод внесет значительный вклад в эту область.