Анализ внеклеточной везикуло-опосредованной кальцификации сосудов с использованием моделей in vitro и in vivo

Этот протокол предоставляет метод, который может быть использован для оценки, а в будущем и для разработки методов лечения кальцификации сосудов, которая является наиболее значимым предиктором сердечно-сосудистых заболеваний. Возможность выделения ЭВ позволяет дополнительно изучить механизмы, приводящие к кальцификации сосудов, и фенотипическое изменение клеток гладкой мускулатуры сосудов. Этот метод дает представление о ранних молекулярных механизмах кальцификации, опосредованной клетками гладких мышц сосудов.

Понимание этого позволяет изучить терапевтические варианты для понимаемого механизма. С помощью этого метода можно изучить любые интересующие электромобили. Он не является исключительным для клеток гладких мышц сосудов, остеобластов или кальцификации сосудов.

После усыпления мыши поднимите кожу пинцетом и сделайте надрез по средней линии. Удалите лишнюю кожу или жир. Затем удалите репродуктивные органы, мочевой пузырь и жир за пределами средней линии.

Затем переместите органы желудочно-кишечного тракта вправо и следуйте по кишечнику по средней линии. После обнаружения поднимите среднюю линию и иссеките желудочно-кишечный тракт до желудка. Иссекайте почки, отрывая их от средней линии.

Разрежьте как можно ближе к почкам. Удалите печень, приподняв доли и отрезав от средней линии. Затем перфузируют сердце и аорту, вводя холодный PBS в правый желудочек с помощью 10-миллилитрового шприца.

Подождите, пока легкие надуются и побелеют. Удалите легкие и лишнюю диафрагму или грудную клетку. Чтобы удалить кость, широко раскройте ножницы и поместите их в нижнюю часть мыши над хвостом.

Срежьте вниз, приподнимите позвоночник от кожи и удалите жир с боков средней линии. Как только кожа отслоится, иссеките позвоночник и неповрежденные органы, разрезав прямо над сердцем. Поместите позвоночник и неповрежденные органы в стакан PBS в ведре со льдом при транспортировке к стереоскопу.

Переместив позвоночник и органы в рассекающую чашку, наполните ее ледяным PBS и придавите позвоночник и грудную клетку с помощью игл. Под диссекционным микроскопом осторожно поднимите сердце с помощью пинцета и начните разрезать над позвоночником и под аортой. Продолжайте это до тех пор, пока не достигнете нижней части позвоночника.

Удалите позвоночник из рассекающей чашки и прижмите сердце и любой посторонний жир или мышцу. Начиная с области прямо под сердцем, определите пищевод, полую вену и аорту. Удалите пищевод и полую вену, чтобы иметь четкое поле зрения аорты.

Используя щипцы и ножницы для микрорассечения, начните поднимать жировую ткань и резать как можно ближе к аорте. Продолжайте это вниз по медиальной линии, пока не обнажятся все аорта и бедренные артерии. В сердце удалите всю жировую ткань, обнажив три ветви дуги аорты.

Удалите корень аорты из левого желудочка, вставив ножницы для микрорассечения в левый желудочек и разрезав мышцу, окружающую аорту. После того, как аорта изолирована и очищена, визуализируйте аорту с помощью сканера ближнего инфракрасного диапазона, чтобы визуализировать кальцификацию сосудов. Используя пользовательский сценарий MATLAB, количественно определите общий сигнал кальциевого индикатора, нормализованный к общей просканированной площади аорты.

Направьте MATLAB к местоположению файлов TIF из ближнего инфракрасного сканирования аорты, откройте отдельные файлы и извлеките значения интенсивности пикселей из файлов TIF. Выберите аорту с наибольшей кальцификацией в качестве максимального масштаба на изображении цветовой карты. Когда в окне появится команда «Сколько образцов на изображении», введите количество аорт на текущем изображении и выберите каждую аорту одну за другой.

После того, как аорта выбрана, MATLAB создаст двоичные изображения с маской общей площади и кальцинированной области аорты. Значения из этих замаскированных изображений затем используются для определения общей кальцинированной площади, общей площади аорты, процентной площади, положительной для кальцификации, и средней интенсивности кальцинированной области. Сразу после сканирования аорты объедините две-три аорты, чтобы получить достаточную концентрацию белка.

Инкубируйте две-три объединенные аорты в 1,5 миллилитрах пищеварительного раствора в течение двух часов при температуре 37 градусов по Цельсию. Соберите раствор и центрифугу по 1 000 г в течение 15 минут удалите клеточный мусор. Затем, чтобы удалить микровезикулы, снова центрифугируйте надосадочную жидкость в течение 30 минут при 33 000 г.

Соберите и оцените надосадочную жидкость на потенциал кальцификации. После удаления клеточного мусора из кондиционированной собранной среды центрифугированием отжимают собранную надосадочную жидкость при 33 000 г в течение 30 минут. Соберите надосадочную жидкость и перенесите ее в новую пробирку.

Затем добавьте 1% от 300 миллимолярного дигидрофосфата натрия к образцам внеклеточных везикул и перемешайте раствор пипеткой. Перелейте 200 микролитров раствора смеси в 96-луночную пластину и инкубируйте 96-луночную пластину в считывателе микропланшетов при 37 градусах Цельсия. Настройте считыватель пластин на регистрацию поглощения на длине волны 340 нанометров каждую минуту.

Пипеткой налейте 300 микролитров раствора коллагена в каждую лунку восьмилуночного стакана и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 72 часов. После инкубации добавьте в лунки 300 микролитров DMEM в качестве контроля. Добавьте 300 микролитров образцов внеклеточной везикуловой среды, собранных ранее, в оставшиеся лунки и инкубируйте в течение шести дней, как показано ранее.

На 10-й день в каждую лунку насыпают пипеткой по 2,5 микролитра смеси OsteoSense и DMEM и выдерживают в течение 24 часов. В конце инкубации визуализируйте гидрогели с фильтрами для флуоресценции OsteoSense через нижнюю часть камеры из покровного стекла с помощью инвертированного микроскопа или сверху с объективом с большим рабочим расстоянием. Оцените количество кальцификатов, размер кальцификации и собранные изображения, используя параметры анализа частиц, доступные в ImageJ.

Затем перейдите в раздел «Изображение», выберите «Настроить» и нажмите «Пороговое значение», чтобы двоичные изображения отображались таким образом, чтобы белый цвет был только сигналом OsteoSense. Затем используйте команду «Анализировать» и нажмите команду «Анализировать частицы», чтобы получить информацию о каждой кальцификации на изображении. Используйте одни и те же пороговые параметры для согласованности для каждого анализируемого изображения.

Оптический сканер ближнего инфракрасного диапазона рассеченных аорт показал более высокий сигнал OsteoSense по всей аорте мыши с хроническим заболеванием почек, чем две аорты контрольных мышей. Кондиционированная среда, полученная из клеток гладких мышц сосудов, культивируемых в прокальцифицирующей среде, показала более высокую абсорбцию на глубине 340 нанометров, чем контрольная среда. Увеличение абсорбции происходило в 1,5 раза быстрее в прокальцифицирующем образце по сравнению с контрольным образцом.

Кондиционированная среда из клеток, культивируемых в прокальцифицирующих условиях, содержала минеральные отложения. При микрорассечении аорты важно осторожно срезать жир, окружающий аорту. Вы хотите, чтобы как можно больше аорты было проанализировано, но это может быть довольно утомительно.

После выделения ЭВ могут быть завершены дополнительные тесты, такие как анализ активности щелочной фосфатазы или иммунологический анализ. Эти тесты дополнительно покажут механизмы и белки, присутствующие в электромобилях.