Создание, поддержание, дифференциация, генетические манипуляции и трансплантация органоидов слезных желез мыши и человека

С помощью органоидов слезных желез можно изучить, как определенные гены контролируют гомеостаз слезных желез. Кроме того, органоиды могут быть использованы для регенеративной медицины. Основное преимущество технологии органоидов слезных желез, полученных из взрослых стволовых клеток, заключается в том, что она позволяет выращивать и изучать здоровые и нетрансформированные эпителиальные клетки слезных желез.

Эти органоиды в конечном итоге могут быть использованы для лечения пациентов с синдромом сухого глаза. Начните с подготовки среды и материала, необходимых для эксперимента, а затем объедините все компоненты среды для разложения перед экспериментом. Предварительно смочите скальпели в этой среде, чтобы кусочки ткани не прилипли к ним.

Извлеките ткань слезной железы мыши из среды, поместите ее в чашку Петри и измельчите с помощью предварительно смоченных скальпелей. Как только кусочки ткани станут менее 0,5 кубических миллиметра, соскребите их с чашки Петри скальпелем и перенесите в 15-миллилитровую пробирку, содержащую среду для разложения. Для очень маленькой биопсии человека поместите его непосредственно в среду для пищеварения, не измельчая.

Инкубируйте 15-миллилитровую пробирку с кусочками ткани до 15 минут на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия. Тем временем сузьте наконечник пипетки Пастера в пламени и предварительно смочите его в основной среде. Чтобы облегчить процесс диссоциации, пипеткой измельченную смесь поднимайте и опускайте каждые пять минут предварительно смоченной суженной пипеткой Пастера.

Когда под микроскопом видно много одиночных клеток и небольших скоплений, остановите диссоциацию, добавив 10 миллилитров базовой среды. После отжима при 400 г в течение пяти минут удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах базовой среды, чтобы повторить промывку и гранулировать ячейки. Удалите крупные, непереваренные кусочки ткани и оставшиеся коллагеновые волокна, процедив измельченную смесь через 70-микрометровое ситечко.

Открутите элюат при 400 г в течение пяти минут. После удаления надосадочной жидкости ресуспендируйте клеточную гранулу в 100 микролитрах холодного внеклеточного матрикса, или ECM, для одной слезной железы мыши и 50 микролитров холодного ECM для биопсии человека, не создавая пузырьков. Засейте до 100 микролитров клеток в лунку 12-луночной суспензионной пластины, используя P200, чтобы получить примерно 20-микролитровые капли в лунке.

Поместите тарелку вверх дном в увлажненный инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на 20–30 минут, чтобы ECM затвердел. Как только ECM затвердеет, добавьте примерно один миллилитр расширительной среды для мыши комнатной температуры на лунку 12-луночной пластины. Только что приготовьте один миллилитр среды для дифференцировки человека, содержащей отдельные компоненты, которые индуцируют секрецию органоидами слезных желез.

На автоматизированном покадровом микроскопе светлого поля установите положения, которые будут отображаться на пластине, временной интервал пять минут и продолжительность четыре часа. Убедитесь, что вся капля ECM видна в каждом положении. Перед началом визуализации удалите питательную среду из лунок для визуализации, не отрывая пластину от микроскопа, и замените ее свежеприготовленной, хорошо ресуспендированной средой для дифференцировки человека, содержащей соединения, включая форсколин и норадреналин.

В качестве отрицательного контроля включите скважину с обновленной дифференциирующей средой. Нажмите кнопку «Выполнить» на микроскопе и проанализируйте результаты через четыре часа. После диссоциации органоидов, как указано в тексте, откажитесь от надосадочной жидкости.

Ресуспендируют клетки в 80 микролитрах электропорационного буфера. В пробирке объемом 1,5 миллилитра подготовьте плазмиды, необходимые для эксперимента. Добавьте плазмиды в клетки и хорошо перемешайте, пипеткой вверх и вниз.

Настройте электропоратор с параметрами для порового импульса и передаточного импульса. Поместите клетки с плазмидами в электропорационную кювету. Немедленно измерьте сопротивление, которое должно составлять от 0,3 до 0,55 ампера, и немедленно электропроводите.

После этого перенесите клетки в 1,5-миллилитровую пробирку и добавьте 400 микролитров электропорационного буфера с добавлением ингибитора Rho-киназы. Дайте клеткам восстановиться при комнатной температуре в течение 30 минут. Далее гранулируйте ячейки по 500 г в течение пяти минут.

После отбрасывания надосадочной жидкости поместите клетки в 200 микролитров ECM. После застывания добавьте среду для расширения мыши. Для приготовления органоидов разделите органоиды слезной железы человека примерно за три дня до дня трансплантации.

Чтобы извлечь органоиды из ECM, добавьте диспазу в питательную среду, чтобы достичь конечной концентрации 0,125 единиц на миллилитр, и тщательно ресуспендируйте капли ECM, чтобы разрушить их, используя P1000. Поместите тарелку обратно в инкубатор с температурой 37 градусов по Цельсию на 30 минут. Ресуспендируют органоиды в 10 миллилитрах основной среды, чтобы вымыть фермент.

После гранулирования клеток в дозе 400 г в течение пяти минут ресуспендируйте их в 50 микролитрах холодной среды для расширения человека, дополненной 5% ECM. Поместите органоидную суспензию на лед, и приступайте сразу к пересадке. Для ортотопической трансплантации мышам аспирируют органоидную суспензию в инсулиновую иглу.

Когда мышь спит, быстро положите ее на бок так, чтобы основная слезная железа была доступна. Введите пять микролитров органоидной суспензии непосредственно через кожу в слезную железу. Позвольте мыши восстановиться и ежедневно оценивайте наличие любого дискомфорта, связанного с трансплантацией, особенно в глазу.

После рассечения слезной железы мыши ферментативное и механическое пищеварение генерировало небольшие фрагменты тканей, включая ацинусы и протоки. При успешном деривации органоидов слезных желез мыши кистозные органоиды диаметром около 500 микрометров были обнаружены через семь дней. Органоиды слезных желез человека росли в виде цист в течение трех-четырех дней и достигали полноценных размеров через 10-14 дней после выделения ткани.

Через пять и семь дней, соответственно, в среде дифференцировки органоиды слезных желез мыши и человека стали более плотными. Применение циклического активатора АМФ форсколина или нейротрансмиттера норадреналина приводило к органоидному отеку менее чем за три часа. При успешной электропорации выросли органоиды, устойчивые к гигромицину.

Растущие клоны органоидов размером более 300 микрометров были отобраны до их дифференциации. ПЦР-амплификация локуса Pax6, на который нацелена направляющая РНК, дала полосу пар оснований 367 для всех выбранных клонов. Один гомозиготный нокаутный клон слезной железы мыши из шести секвенированных был получен с использованием направляющей РНК, нацеленной на Pax6.

Некоторые клоны росли хорошо, но некоторые клоны органоидов были потеряны после сбора или начали дифференцироваться. Из 10 отобранных клонов органоидов семь хорошо выросли. Приживление органоидов было подтверждено через месяц после введения органоидов в слезную железу мыши путем окрашивания на специфический для человека маркер, ядрышковый антиген человека.

Одна вещь, на которую следует обратить внимание, - это не переваривать ни ткани, ни органоиды. В противном случае клетки могут погибнуть, и это снизит скорость образования органоидов. Органоиды слезных желез могут быть проанализированы с помощью гистологии.

Таким образом, можно получить представление об их клеточном составе.