Визуализация органелл in situ с помощью крио-STEM-томографии

ПЭМ-томография широко используется для визуализации клеток, но она очень ограничена с точки зрения толщины образца. FIB SEM и мягкая рентгеновская томография могут использоваться для более крупных образцов, хотя и с более низким разрешением. STEM-томография прекрасно восполняет этот пробел.

STEM-томография позволяет взглянуть на образцы толщиной в микроны с разрешением в несколько нанометров. Комбинация с криогенной подготовкой позволяет рассматривать биологические образцы и срезы в 3D. Ознакомьтесь с основами оптики STEM, чтобы понять формирование изображения и убедиться, что сервисный инженер хорошо выровнял режимы штока и штока Lomax, а этапы калибровки выглядят так, как показано на видео.

Для начала загрузите файл выравнивания столбцов и откройте значения столбцов. При использовании криодержателя с боковым входом откройте криоэкран и запустите его в режиме TEM. Луч должен появиться на экране.

Уменьшите увеличение, если луч не отображается. Приведите микроскоп в эуцентрический фокус, нажав кнопку на панели управления. Установите размер пятна на удобное значение для визуализации флуоресцентного экрана напрямую или с помощью встроенной камеры.

Переведите микроскоп в режим STEM и убедитесь, что в фокусе используются конденсорные линзы, а не объектив. На панели установите эуцентрический фокус и выйдите из режима дифракции для первоначальной настройки. Убедитесь, что луч не пустой, и уменьшайте увеличение, пока луч не появится на экране.

Отрегулируйте смещение луча к центру и увеличивайте увеличение с шагом до 70 000, удерживая луч в центре. Затем вставьте желаемую апертуру конденсатора, обычно 50 микрометров для режима микрозонда, и проверьте центрирование диафрагмы. При повороте ручки фокусировки вперед и назад пятно должно расширяться и сжиматься, но оставаться на месте, как будто плоскость разрезает воображаемые вертикальные песочные часы.

Если диафрагма не отцентрирована, освещение будет смещаться вбок, как если бы песочные часы были наклонены. Наведите луч на фокус, нажмите кнопку фокусировки по списку интенсивности на вкладке выравнивания или вернитесь к эуцентрической фокусировке. Отрегулируйте положение луча по центру и отрегулируйте центр вращения.

Теперь поверните ступенчатое колесо фокусировки на минимум или на одну ступень выше, чтобы луч мягко пульсировал и оставался неподвижным, когда фокус перемещается вверх и вниз. Выделите точки поворота и соедините две точки с помощью корректировок X и Y. Отрегулируйте стигмеры конденсатора, чтобы сделать луч круглым.

Перемещайтесь вверх и вниз по фокусу для оптимизации. Не должно быть тенденции к удлинению в ту или иную сторону при прохождении через фокус. Нормализуйте линзы, затем постепенно увеличивайте увеличение примерно до 240 000, используя сдвиг луча, чтобы удерживать пятно по центру, и повторите регулировку центра вращения и точки поворота.

Вернитесь в режим дифракции. На этом этапе луч должен появиться в виде однородного диска на флуоресцентном экране. Длина камеры теперь эффективно контролирует оптическое расстояние до детектора в виде рентгеновской кристаллографии.

Измените его и наблюдайте, как диск сжимается и увеличивается, как если бы расположение экрана двигалось к образцу или от него. Этот конус представляет собой освещение светлого поля. Чтобы включить режим STEM с большим увеличением, начните с детектора светлого поля и отрегулируйте дифракционное выравнивание, чтобы центрировать луч, используя желаемую длину камеры.

Включите разметку светлого поля на экране, уменьшите длину камеры до 330, поднимите экран и вставьте датчики. Запустите сканирование в программном обеспечении микроскопа. Используйте дисплей оптического прицела для регулировки параметров яркости и контрастности, как описано в рукописи.

Повторите настройку несколько раз. Верните микроскоп к относительно низкому увеличению в регистре с большим увеличением, не входя в режим малого увеличения. Вставьте флуоресцентный экран и запишите ток экрана для справки.

Как и в TEM, ток может быть изменен с помощью настройки объектива пушки и размера пятна с увеличением чисел, соответствующих уменьшенному току. На этом этапе сохраните регистр FEG, чтобы облегчить возврат к стандартным значениям. Перейдите в режим LMTEM, чтобы увидеть образец.

Вставьте образец. Доведите образец до эуцентрической высоты. Для этого есть несколько способов.

Например, с помощью воблера предметного столика можно наклонять сетку, перемещая высоту образца вдоль оси Z до тех пор, пока изображение не перестанет смещаться вбок. Кроме того, отметьте некоторые функции на экране просмотра и наклоните сцену на 10–30 градусов. Объект будет перемещаться в боковом направлении.

Отрегулируйте высоту образца, чтобы вернуть его в исходное положение. Увеличьте увеличение или наклон сцены, чтобы уточнить и вернуть наклон к нулю градусов. Теперь вернитесь в режим STEM и вставьте детектор STEM.

Убедитесь, что флажок «Включить сканирование LM» снят. Перейдите в режим наименьшего большого увеличения. Настройте конденсаторный астигматизм методом.

Наведя луч на тонкую область образца, сфокусируйтесь на точке, где проходящий луч взрывается между теневыми изображениями образца с обеих сторон. Затем отрегулируйте настройку конденсатора, чтобы сделать центральный диск круглым. Это требует некоторой практики, особенно для криогенных образцов.

Вернитесь к апертуре 50 микрометров и обновите регистр FEG. Перейдите в режим LMSTEM и продолжите сканирование, чтобы найти интересную область. При необходимости отрегулируйте настройки яркости и контрастности датчика примерно на этом этапе.

Нажмите на эуцентрическую фокусировку, увеличьте увеличение и уточните фокусировку во время сканирования с помощью контура фокусировки, предоставляемого микроскопом, и проверьте астигматизм на золотых бусинах. До сих пор все выполняется в режиме нанозонда. Обратите внимание, что установка меньшего отверстия конденсатора уменьшает угол полусходимости, что полезно для толстых образцов.

Альтернативным подходом с приборами TFS является переключение в режим микрозонда, что приводит к уменьшению угла полусходимости. Затем отрегулируйте длину камеры так, чтобы угол сбора был в три раза больше, чем угол сходимости; т. е. маркировка области детектора BF на экране примерно в три раза больше, чем луч.

Оцените дозу для записи с помощью уравнения. Как правило, нацельтесь от 100 до 150 электронов на квадратный чернильный столб для всего томографа. Верните сцену в единое целое и отрегулируйте ток луча, используя размер пятна и/или настройки объектива пистолета, чтобы достичь желаемого тока экрана.

Карта сетки с полным малым увеличением, записанная в режиме STEM, показывает области с интересующими ячейками. Клетки кажутся частично яркими с электронами, рассеянными по направлению к детектору HAADF. Карта среднего разрешения, записанная в режиме STEM, отображала две якорные карты среднего разрешения.

Наклон на ноль градусов серии наклонов ствола позволил визуализировать отложения фосфата кальция, кристы и золотые фидуциальные маркеры митохондрии. Показан объемный рендеринг срезов толщиной 60 нм и 40 нм. Криостволовая томография, или CSTET, обеспечивает мост между структурной биологией и клеточной биологией, а также контекст для флуоресценции сверхвысокого разрешения.

Без необходимости секционирования или подготовки ламелей мы можем видеть весь клеточный театр в почти нативном состоянии.