Количественная оценка и полногеномная характеристика РНК SARS-CoV-2 в пробах сточных вод и воздуха

Эпидемиология сточных вод в настоящее время используется для дополнения стратегий борьбы с COVID-19 во всем мире путем обнаружения вирусной РНК в пробах сточных вод и выявления потенциальных вспышек. Этот метод позволяет получить представление о распространенности COVID-19 в нашем сообществе в масштабах всего населения, включая бессимптомные случаи. Отбор проб воздуха также является важным дополнением к этому протоколу.

Клиническая диагностика по-прежнему остается наиболее точным способом борьбы со вспышками болезней и пандемиями. Тем не менее, эта техника все же полезна в качестве дополнения к нему. Этот метод имеет множество этапов и критических точек.

Визуальная демонстрация необходима, так как она позволит лабораториям, которые не так хорошо знакомы с молекулярной биологией, воспроизвести процедуру. Для начала соберите один литр составной пробы сточных вод за 24 часа. Добавьте 20 микролитров менговируса в 70 миллилитров образца.

После центрифугирования образца при 700G в течение 10 мин концентрируют полученную надосадочную жидкость с помощью центробежного ультрафильтрационного устройства с отсечкой 10 килодальтон центрифугированием. Элюируют концентрат, центрифугируя при 700G в течение 40 минут и инвертируя положение ультрафильтрационного устройства. Полученный концентрат используют для экстракции РНК.

Чтобы собрать пробы воздуха, поместите стерильный конус в пробоотборник воздуха перед началом сбора. После того, как отбор проб завершен, извлеките РНК из промытого PBS конуса с помощью коммерческого набора для экстракции вирусной РНК или собственным методом. Приготовьте мастер-микс реакций для каждой мишени, генов менговируса, SARS-CoV-2, N1 и N2 в чистом колпаке в комнате настройки реагентов.

Смешайте праймерно-зондовую смесь и фермент путем пятикратного переворачивания или импульсного вихряния. Храня пробирки для микроцентрифуг в холодном штативе, распределите 15 микролитров смеси в стрип-пробирки для ПЦР или 96-луночный ПЦР-планшет, размещенный на охлаждающей стойке. Накройте пластину и переместите ее в зону работы с нуклеиновыми кислотами.

Осторожно встряхните аликвоту извлеченной РНК в течение пяти секунд. Пипеткой поместите пять микролитров РНК в реакционную смесь, чтобы получилось 25 микролитров, и начните ОТ-кПЦР. В ПЦР-планшет наберите пипеткой 16 микролитров каждого образца до его положения на планшете и добавьте четыре микролитра пятикратной обратной транскрипции или мастер-смеси ОТ.

Затем запускают реакцию ПЦР. Затем приготовьте 10 микромолярных разведений каждого набора праймеров и мастер-микс для каждого набора праймеров. В новую ПЦР-пластину пипеткой 20 микролитров мастер-смеси, затем пять микролитров образца RT в каждую смесь.

Накрыв пластину, запускают реакцию ПЦР. Как только ПЦР закончится, вращайте планшет при 1000 G в течение 15-30 секунд. Для очистки ПЦР добавьте 50 микролитров реагента на основе гранул в каждую лунку и перемешайте пипеткой, чтобы продолжить магнитную сепарацию.

Снимите пластину с магнитной подставки. Ресуспендируйте каждую гранулу с 15 микролитрами воды ПЦР и инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение двух минут. Поместите пластину обратно на магнитную подставку и дайте шарикам окатыться в течение двух минут.

Затем осторожно пипеткой 15 микролитров надосадочной жидкости из каждого образца на новую ПЦР-пластину. Затем для приготовления библиотеки добавьте в каждый образец 1,75 микролитра реакционного буфера из набора для подготовки библиотеки ДНК и 0,75 микролитра ферментной смеси. Кратковременно встряхните накрытую тарелку и вращайте вниз при 1000G в течение 15–30 секунд.

Инкубируйте в течение пяти минут при температуре 21 градус Цельсия и пять минут при температуре 65 градусов Цельсия. Пипеткой три микролитра воды ПЦР-класса для каждого образца на новую ПЦР-пластину. Добавьте 0,75 микролитра подготовленных образцов и 1,25 микролитра штрих-кодов для секвенирования библиотечной подготовки.

Затем добавьте пять микролитров мастер-смеси ДНК-лигазы Т4 и хорошо перемешайте пипетированием. После вращения планшета в центрифуге инкубируйте планшет при температуре 21 градус Цельсия в течение 20 минут и при температуре 65 градусов Цельсия в течение 10 минут. После объединения всех образцов добавьте в пул 192 микролитра реагента на основе гранул для очистки ПЦР.

Хорошо перемешайте пипеткой и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут. Поместите трубку на магнитную подставку. Подождите, пока надосадочная жидкость рассеется и образуется гранула.

Извлеките надосадочную жидкость и трубку из магнитной подставки. Добавьте 700 микролитров буфера для коротких фрагментов или SFB и перемешайте пипетированием. Поместите пробирку обратно на магнитную подставку и подождите, пока образуется гранула и жидкость не очистится.

Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки. Добавьте в пробирку 35 микролитров воды ПЦР-класса, перемешайте пипеткой и инкубируйте при комнатной температуре в течение двух минут. Поместите трубку на магнитную подставку и дайте шарикам превратиться в гранулы, а жидкости — прозрачность.

Пипеткой 35 микролитров надосадочной жидкости в новую пробирку. Затем приготовьте реакционную смесь для переходного лигирования, как описано в текстовой рукописи, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут. Смешайте 20 микролитров реагента на основе гранул со смесью для реакции лигирования для очистки ПЦР и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.

Поместите пробирку на магнитную подставку и подождите, пока сформируется гранула гранулы, а надосадочная жидкость станет бесцветной. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость путем пипетирования. Смешайте 125 микролитров SFB с пробиркой и поместите ее обратно на магнитную подставку, чтобы отделить шарики.

Когда жидкость станет прозрачной, выбросьте надосадочную жидкость и повторите добавление SFB, как показано ранее. Оставьте трубку на магнитной подставке открытой на 30 секунд. Добавьте 15 микролитров элюирующего буфера и хорошо перемешайте пипетированием.

После короткого отжима и инкубации при комнатной температуре в течение пяти минут поместите на магнитную подставку на две минуты. Пипетку 15 микролитров надосадочной жидкости поместить в новую пробирку с низким связыванием для измерения концентрации с помощью флуорометрического набора для количественного определения ДНК. Затем вставьте проточную ячейку в устройство секвенирования ДНК и РНК в режиме реального времени.

Вставьте наконечник пипетки объемом 1 000 мкл, установленной на 200 мкл, в отверстие для заливки. Поверните колесико регулировки громкости, чтобы увеличить громкость, пока не увидите жидкость в наконечнике, а затем выбросьте наконечник. Добавьте 800 микролитров грунтовочной смеси в заливочное отверстие без пузырьков и подождите пять минут.

Пипетку на 200 микролитров библиотеки размешайте в заливочном отверстии. Закройте отверстие крышки и отверстие для заливки. Запустите эксперимент по секвенированию в программном обеспечении и выберите Base Calling On.Этот метод обнаружил и количественно оценил РНК SARS-CoV-2 в пробах сточных вод и воздуха.

Пробы сточных вод имели стандартное отклонение от 1,91% до 13,98% среди трипликатов и варьировались от 3,05 умножить на 10 до 3 до 2,83 умножить на 10 до восьми генных копий на литр. Пробы воздуха варьировали от 6,17 умножить на 10 до трех и 5,48 умножить на 10 к девяти, со стандартным отклонением в дубликатах от 0,54% до 10,95%Как описано в этом протоколе, пробы были секвенированы, и пример трех секвенированных результатов проб обобщен здесь. Во всех трех образцах линия BA.5.

x был назначен наиболее распространенным инструментом Фрейи. Концентрация проб сточных вод является решающим этапом, поскольку вирусная РНК присутствует в сточных водах в низких концентрациях. Таким образом, этот шаг имеет основополагающее значение для точного обнаружения и количественной оценки.

Эта процедура может быть адаптирована путем использования различных праймеров в протоколе ОТ-кПЦР, которые будут использоваться для обнаружения и количественного определения других инфекционных агентов. Этот метод позволил точно количественно определить содержание SARS-CoV-2 в пробах сточных вод и воздуха. Различные патогены могут быть обнаружены и количественно определены в разных местах.