Measuring Embryonic Viability and Brood Size in <em>Caenorhabditis elegans</em>

Ji Kent Kwah; Aimee Jaramillo-Lambert

doi:10.3791/65064

Измерение эмбриональной жизнеспособности и размера расплода у Caenorhabditis elegans

JoVE Journal
Genetics

This content is Free Access.

JoVE Journal Genetics

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Измерение эмбриональной жизнеспособности и размера расплода у Caenorhabditis elegans

Full Text

3,598 Views

06:24 min

February 24, 2023

DOI: 10.3791/65064-v

Ji Kent Kwah¹, Aimee Jaramillo-Lambert¹

¹Department of Biological Sciences,University of Delaware

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This article presents a method for determining embryonic viability and brood size in the model organism C. elegans. The protocol is designed for novice researchers and provides clear instructions for assessing developmental processes.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Developmental Biology
Genetics

Background

Brood size and embryonic viability are critical indicators of developmental health.
Defects in these areas can signal issues in myosis, fertilization, and embryogenesis.
Understanding these processes is essential for genetic studies in C. elegans.
Identification of embryos versus unfertilized eggs is a key challenge for researchers.

Purpose of Study

To provide a standardized method for measuring brood size and embryonic viability.
To assist novice researchers in conducting experiments with C. elegans.
To facilitate the identification of genetic factors affecting development.

Methods Used

Transfer of individual L4 stage hermaphrodites to culture plates.
Scoring of embryos and larvae at specified intervals.
Use of differential cell counters for accurate counting.
Recording observations in laboratory notebooks for data accuracy.

Main Results

The viability percentage for the N2 strain was 98.9%.
Strains him-5(e1490) and spo-11(ok79) showed reduced viability at 74.9% and 0.8%, respectively.
The average brood sizes were 217 for N2, 105 for him-5(e1490), and 219 for spo-11(ok79).
Familiarity with C. elegans developmental stages is crucial for accurate data collection.

Conclusions

This method is a valuable first step in genetic studies related to development.
Clear identification of developmental stages enhances data reliability.
Further cytological analyses can follow to explore disrupted processes.

Frequently Asked Questions

What is the significance of brood size in C. elegans?

Brood size is an important indicator of reproductive success and developmental health in C. elegans.

How can I identify embryos versus unfertilized eggs?

Practice is essential; familiarize yourself with the different developmental stages using images and a microscope.

What temperature should be maintained during the experiment?

The standard culturing temperature is 20 degrees Celsius.

What tools are recommended for counting larvae and embryos?

A differential cell counter and a gridded plate are recommended for accurate counting.

How do I record my observations?

Observations should be meticulously recorded in a laboratory notebook for data accuracy.

What challenges might I face when conducting this experiment?

Identifying embryos and ensuring proper mating between hermaphrodites and males can be challenging.

Здесь мы представляем общий метод определения эмбриональной жизнеспособности и общего количества эмбрионов, полученных (выводка) с использованием модельного организма C. elegans.

Этот протокол для определения размера расплода и эмбриональной жизнеспособности используется многими лабораториями C.elegans. Уменьшение грубых размеров и эмбриональной жизнеспособности может указывать на дефекты в важных процессах развития, таких как миоз, оплодотворение и эмбриогенез. Эта методика дает четкие инструкции для начинающих исследователей C.elegans.

Он относительно прост в настройке и выполнении и является отличной отправной точкой при работе с новыми мутантными штаммами. Самой большой проблемой для этого метода является идентификация эмбриона по сравнению с неоплодотворенным эмбрионом. Новые исследователи должны практиковать идентификацию эмбрионов, ооцитов и различных личиночных стадий, прежде чем начинать эти эксперименты.

Для начала пометьте заднюю часть тарелки, перенесите на тарелку отдельный гермафродит стадии L4. Убедитесь, что эмбрионы или другие черви не переносятся на тарелку. Дайте червям развиться во взрослых особей и отложите самостоятельное потомство в течение 24 часов при стандартной температуре выращивания 20 градусов по Цельсию.

Забейте тарелку на третий день. На следующий день пометьте набор новых пластин и перенесите на новую тарелку одного отдельного червячка. Дайте червям отложить эмбрионы в течение 24 часов при температуре 20 градусов по Цельсию.

Забейте тарелку на четвертый день. На третий день пометьте набор новых тарелок и перенесите на новую тарелку отдельных червей второго дня. Дайте червям отложить потомство в течение 24 часов при температуре 20 градусов.

Забейте тарелку на пятый день. Нарисуйте узор сетки на 35-миллиметровой крышке мелким маркером. Поместите решетчатую крышку под тестовую пластину для подсчета, чтобы отслеживать ранее подсчитанных червей.

Используя дифференциальный счетчик клеток, подсчитайте живых личинок и невылупившихся эмбрионов в пределах отдельного квадрата. Для червей на квадратных границах подсчитайте исходя из расположения головы червя. Посчитайте червей с головами, касающимися верхнего и левого краев квадрата.

Запишите количество живых личинок и невылупившихся эмбрионов в лабораторную тетрадь. На четвертый день подсчитайте тарелку второго дня, подсчитав живых личинок и невылупившиеся эмбрионы, и запишите их в лабораторную тетрадь. На пятый день подсчитайте тарелку третьего дня, подсчитав живых личинок и невылупившиеся эмбрионы, и запишите их в лабораторную тетрадь.

После маркировки обратной стороны пластины перенесите на пластину отдельного червя-гермафродита L4. Убедитесь, что эмбрионы или другие черви не переносятся на тарелку. Перенесите одного червя-самца L4 на пластину, содержащую гермафродита L четыре.

Дайте червям спариться и отложить потомство в течение 24 часов при температуре 20 градусов по Цельсию. Оцените тарелку на наличие живых личинок по сравнению с невылупившимися эмбрионами на третий день. На следующий день пометьте набор новых тарелок и перенесите гермафродита и самца на новую тарелку.

Следите за тем, чтобы гермафродит достиг совершеннолетия. Дайте гермафродитам отложить потомство в течение 24 часов при температуре 20 градусов по Цельсию. Оцените тарелку на наличие живых личинок по сравнению с невылупившимися эмбрионами на четвертый день.

На третий день пометьте набор новых тарелок и перенесите гермафродита и самца на новую тарелку. Дайте червям отложить потомство в течение 24 часов при температуре 20 градусов. Оцените тарелку для живых и невылупившихся эмбрионов на пятый день.

Используя дифференциальный счетчик клеток, подсчитайте живых личинок и невылупившихся эмбрионов с первого дня и запишите их в лабораторную тетрадь. На четвертый день подсчитайте живое потомство и невылупившиеся эмбрионы со второго дня и запишите их в лабораторную тетрадь. Проверьте тарелку первого дня для мужчин.

Если спаривание произошло, ожидаемое генетическое соотношение гермафродитов и самцов составляет 50 к 50. Если в первый день на тарелке нет ни одного самца, спаривания между самцом и гермафродитом не происходило. Откажитесь от этой брачной пары и запишите наблюдение в лабораторную тетрадь.

На пятый день подсчитайте живых личинок и невылупившиеся эмбрионы с третьего дня и запишите их в лабораторную тетрадь. Анализ эмбриональной жизнеспособности для N2 дал процент жизнеспособности 98,9%, в то время как и him-5 (e1490), и spo-11 (ok79) показали снижение эмбриональной жизнеспособности с процентом 74,9% и 0,8% соответственно. Средний размер выводка N2, him-5(e1490) и spo-11(ok79) был определен как 217, 105 и 219 соответственно.

Распознавание различных стадий развития C.elegans важно для точных и воспроизводимых данных. Мы рекомендуем ознакомиться с развитием червя с помощью изображений и препарирующего микроскопа. Эта процедура является отличным первым шагом для определения того, участвует ли ген в процессе развития, и за ней могут последовать цитологические анализы, чтобы определить, какой процесс нарушен.