Двухцветное оптическое картирование сердец у мышей RyR2R2474S с катехоламинергической полиморфной желудочковой тахикардией

Этот метод поможет выявить электрофизиологические свойства и механизмы мазков остановки желудочков, связанных с такими заболеваниями, как катехоламинергическая полиморфная желудочковая тахикардия. Используя этот метод, мы можем одновременно получать мембранный потенциал и межклеточные кальциевые сигналы по различным протоколам электростимуляции, что особенно подходит для изучения основных механизмов и динамики сердечной аритмии, такой как CPVT. Чтобы провести этот эксперимент успешно, убедитесь, что у вас есть хорошо перфузионное сердце, правильная загрузка красителя, развязка возбуждения-сжатия и тщательная настройка камеры.

Для начала настройте систему оптического картографирования и включите камеру для стабильной температуры отбора проб в минус 50 градусов по Цельсию. Поместите собранное сердце мыши в холодный раствор CREB, чтобы замедлить метаболизм и защитить сердце. Удалить окружающие ткани аорты.

Используйте изготовленную на заказ иглу для канюляции, чтобы канюлировать его, и зафиксируйте его шелковым швом 4-0. Теперь перфузии сердца с помощью системы Лангендорфа с постоянной скоростью от 3,5 до 4,0 миллилитров в минуту. Вставьте маленькую пластиковую трубку в левый желудочек, чтобы уменьшить скопление раствора в камере, чтобы избежать перегрузки, и зафиксируйте пластиковую трубку в канюлирующей игле.

Затем поместите два вывода в перфузат в ванне и включите питание блока усилителя электрокардиограммы и контроллера электростимуляции. Затем запустите указанное программное обеспечение для электрокардиограммы или ЭКГ и непрерывно контролируйте ЭКГ. Последующие действия выполняйте в темноте, когда сердце достигнет стабильного состояния.

Перфузируйте смесь раствора блеббистатина CREBs постоянно в сердце в течение 10 минут, чтобы отделить сокращение от возбуждения и избежать артефактов сокращения во время съемки. Затем с помощью красного фонарика осмотрите сердце, чтобы подтвердить полное прекращение сокращений. Перфузии сердца рабочим раствором Rhod-2 AM в течение 15 минут в перфузионной системе Лангендорфа после развязки возбуждения.

Поддерживают поступление кислорода во время внутриклеточной загрузки кальциевым красителем. Чтобы предотвратить образование пузырьков от плюронического F-127, вставьте пузырьковую ловушку в перфузионную систему. Разведите 10 микролитров исходного раствора RH 237 в 50 миллилитрах перфузата и загружайте на 10 минут.

После завершения загрузки двойного красителя сделайте последовательность фотографий. Убедитесь, что сигналы напряжения и кальция достаточны для анализа. Включите два светодиода для ламп возбуждения и отрегулируйте их интенсивность до нужного диапазона.

Поместите сердце под детектирующее устройство, убедившись, что оно хорошо освещено двумя светодиодами, регулирующими диаметр светового пятна до двух сантиметров. Установите рабочее расстояние между объективом и сердцем на уровне 10 сантиметров, чтобы добиться желаемой частоты дискретизации и пространственного разрешения. Откройте программное обеспечение для выборки сигналов, чтобы одновременно управлять камерой и захватывать сигналы напряжения и кальция.

Запустите стимулятор поля MyoPacer и установите шаблон стимуляции на транзисторную логику с длительностью кардиостимуляции в две миллисекунды на импульс. Установите начальную интенсивность на 0,3 вольта. Расположите пару платиновых электродов, прикрепленных к эпикарду верхушки левого желудочка.

Примените 30 последовательных стимулов 10 герц S1, чтобы проверить порог диастолического напряжения сердца с помощью программного обеспечения для записи ЭКГ. Постепенно увеличивайте амплитуду напряжения до тех пор, пока не будет достигнут захват один к одному. Внедрите протокол S1-S1 для измерения альтернатив кальция или потенциала действия и восстановительных свойств.

Последовательно выполняйте сердечные сокращения, начиная с базовой длины цикла 100 миллисекунд. Уменьшайте длину цикла на 10 миллисекунд в каждой последующей последовательности, пока она не достигнет 50 миллисекунд. Одновременно инициируйте оптическое картирование перед стимуляцией.

Чтобы измерить эффективный рефрактерный период желудочков с помощью протокола стимуляции S1-S2, начните с длительности цикла стимуляции S1-S1 в 100 миллисекунд. Соедините S2 через 60 миллисекунд и уменьшайте с шагом в две миллисекунды до тех пор, пока S2 не сможет захватить эктопический комплекс QRS. Для индукции аритмии введите постоянную импульсную стимуляцию с частотой 50 Гц и выполните тот же эпизод кардиостимуляции, выждав двухсекундный интервал отдыха.

Внимательно следите за записями электрокардиограммы в течение непрерывного высокочастотного периода стимуляции, чтобы своевременно начать одновременную запись оптического картирования при генерации интересной аритмической волны. Приступайте к съемке изображений с помощью камеры устройства с умножением заряда электронов. В программном обеспечении для получения изображений нажмите «Выбрать папку» и загрузите изображения, чтобы начать полуавтоматический процесс анализа больших объемов видеоданных.

Введите правильные параметры выборки для анализа. Вручную установите порог изображения и выберите интересующую область. Примените пространственный фильтр Гаусса размером три на три пикселя, фильтр Савицкого-Голея и коррекцию базовой линии цилиндра.

Затем нажмите Process Images, чтобы удалить базовую линию и рассчитать электрофизиологические параметры, такие как APD-80 и CATD-50. Для расчета APD-80 установите время начала действия длительности потенциала на пике и конечную точку на 80%реполяризации. Аналогично определите время начала переходной длительности кальция как пик с конечной точкой 80%-ной релаксации.

Показаны типичные трассы на тепловых картах APD-80 и CATD-80. Изопротеренол укорачивает APD-80 и мышей дикого типа, а также катехоламингическую полиморфную желудочковую тахикардию или CPVT, но после провокации изопротеренолом различий обнаружено не было. У мышей с CATD-80 и CPVT после введения изопротеренола наблюдалось дольше, чем у дикого типа, в то время как до лечения не было никакой значимости.

Согласно сигналам напряжения, сердца дикого типа и сердца CPVT обладали одинаковой проводимостью через эпикард на исходном уровне и после вмешательства изопротеренолом. Тепловые карты показали, что мыши CPVT обладают такой же способностью к проводимости, как и мыши дикого типа до и после испытания изопротеренолом. Анализ альтернативной амплитуды кальция показал, что кальциевые сигналы в сердцах дикого типа оставались стабильными на исходном уровне во время последовательной стимуляции S1-S1 на частотах 14,29 и 16,67 Гц, в то время как сердца CPVT показывали частотно-зависимые альтернативы.

После введения изопротеренола сердца CPVT демонстрировали частотно-зависимые альтернативы и кальциевый сигнал во время кардиостимуляции S1-S1, в то время как сердца дикого типа не подвергались влиянию. Анализ тахиальной аритмии показал, что сердца как дикого типа, так и сердца CPVT демонстрируют нормальную проводимость во время пиковой стимуляции 50 герц на исходном уровне. После обилия изопротеренола сердца CPVT показали высокочастотные роторы после всплеска частоты 50 герц, в то время как сердца дикого типа сохранили нормальную проводимость.

После этой процедуры для иллюстрации электрофизиологических и функциональных свойств в этих моделях или при изобретении фармацевтических препаратов используются адогенные типы и мыши дикого типа. Оптическое картирование является мощным инструментом для изучения нарушений сердечного ритма, однако оно не может быть использовано клинически из-за ограниченности флуоресцентного красителя при развязке сокращения возбуждения. С развитием флуоресцентных ламп, подходящих для различных молекул-мишеней, с развитием высокооборотной вычислительной техники, метод картирования сердечной оптики обречен на достижение только приложений.