Производство нейрогенин-2-индуцируемых нейронов человека в трехмерном суспензионном биореакторе

Использование биореакторов для перевода индуцированных плюрипотентных стволовых клеток или протоколов культивирования IPSC из 2D в 3D позволяет генерировать клетки в больших количествах для крупномасштабных применений, таких как высокопроизводительные скрининги. Этот протокол быстрой дифференцировки нейронов в физиологической 3D-среде улучшает взаимодействие стартовых клеток и обеспечивает высокий выход клеток за более короткий промежуток времени с низкой вариативностью партии к = партии, тем самым снижая затраты и время. Европейский банк индуцированных плюрипотентных стволовых клеток применяет аналогичные подходы для быстрого и экономически эффективного получения дифференцированных клеток по нескольким линиям, включая другие клетки мозга и кардиомиоциты.

Начинайте предварительное культивирование, когда индуцированная человеком плюрипотентная стволовая клетка или человеческая культура ИПСК на 60-80% сливается. Полностью аспирируйте среду из ИПСК человека и осторожно промойте клетки 1X DPBS дважды. Добавьте два миллилитра предварительно подогретого раствора трипсина ЭДТА в шестисантиметровую чашку Петри и инкубируйте клетки в течение трех минут при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе.

Затем осторожно постучите по посуде, чтобы облегчить отслоение клеток, или инкубируйте еще одну-две минуты, если клетки не отделяются. Затем ресуспендируйте клетки в каждой чашке, добавив пять миллилитров поддерживающей среды IPSC без питателя с ингибитором ROCK. Переложите клеточную суспензию в 15-миллилитровую или 50-миллилитровую пробирку и аккуратно перемешайте пипеткой, чтобы обеспечить сингуляризацию клеток.

Определите количество клеток в 100 микролитрах клеточной суспензии с помощью автоматического счетчика клеток и перенесите желаемый объем клеточной суспензии в 50-миллилитровую пробирку. Центрифугируйте клетки при 300 G в течение трех минут. Затем аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют клетки в двух миллилитрах поддерживающей среды IPSC без питателя с ингибитором ROCK.

Наполните каждую 50-миллилитровую пробирку 18 миллилитрами среды. Затем распределите 20 миллилитров клеточной суспензии в каждую пробирку биореактора. Поместите пробирки в систему биореактора и установите параметры культивирования на неограниченное время.

Запустите программу предварительного культивирования с помощью дисплея биореактора. Чтобы сменить среду на следующий день, дайте заполнителю осесть в трубках биореактора примерно на пять минут, прежде чем осторожно отсасывать надосадочную жидкость. Добавьте 15 миллилитров свежей питательной среды IPSC без ингибитора ROCK на пробирку и продолжайте культивирование в настольном биореакторе в течение 24 часов.

Чтобы начать дифференцировку нейронов, дайте агрегату осесть в трубках биореактора и осторожно аспирируйте надосадочную жидкость из клеток, оставив в трубке около пяти миллилитров надосадочной жидкости. Затем добавьте 35 миллилитров среды нейронной индукции, состоящей из нейробазальной среды, и два микрограмма на миллилитр доксициклина. Поместите трубки обратно в настольный биореактор и продолжайте выращивание.

Выполняйте смену носителя каждый день в течение двух дней, как было показано ранее. После аспирации надосадочной жидкости, как показано ранее, переложите заполнители в стерильную 15-миллилитровую или 50-миллилитровую пробирку и осторожно промойте заполнители два раза с помощью DPBS. Максимально тщательно аспирируйте надосадочную жидкость, не нарушая агрегаты.

Затем добавьте от двух до пяти миллилитров предварительно разогретого фермента диссоциации клеток в гранулы, в зависимости от размера гранул, и инкубируйте клетки в течение примерно 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия на водяной бане. Осторожно ресуспендируйте осажденные агрегаты каждые две минуты, пока агрегаты не диссоциируют. Добавьте предварительно подогретую нейробазальную среду, в три раза превышающую объем ранее добавленного фермента диссоциации клеток, и осторожно ресуспендируйте клетки, чтобы обеспечить сингуляризацию клеток.

Определите номера клеток и перенесите соответствующий объем клеточной суспензии для криоконсервации в 15-миллилитровую или 50-миллилитровую пробирку. Центрифугу до клеток при 300 г в течение трех минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и осторожно ресуспендируйте гранулу ячейки в соответствующем объеме замораживающей среды, содержащей 10% диметилсульфоксида.

Аликвотируют клеточную суспензию в подходящие флаконы для криоконсервации. Немедленно переложите флаконы в предварительно охлажденный контейнер для медленного замораживания, заполненный 2-пропанолом, и поместите контейнер при температуре минус 80 градусов по Цельсию на ночь. Поместите флаконы при температуре минус 150 градусов по Цельсию на следующий день для длительного хранения.

После того, как адгезивные культуры человеческих ИПСК были отделены, сингуляризированы и перенесены в суспензию, агрегаты сформировались в течение 24 часов и продолжали расти. После двух дней индукции трансгена ранние нейроны могут быть криоконсервированы для последующего созревания. Наблюдалась стойкая пролиферация ИПСК человека в течение первых дней в суспензии, а количество клеточных культур достигло пика после двух дней индукции.

Однако длительное культивирование в течение более четырех дней в суспензии не улучшило выход клеток, поскольку агрегаты становились все более устойчивыми к ферментативной сингуляризации. Кроме того, по сравнению с нулевым днем, диаметр заполнителя увеличился на 50% на второй день и почти удвоился на пятый день. Хотя увеличение диаметра ограничивает поступление питательных веществ в агрегаты, жизнеспособность клеток не была затронута на второй или пятый день дифференцировки.

Временной профиль экспрессии генов, а также иммунохимическое окрашивание нейрональных маркеров бета-три тубулина и белка, связанного с микротрубочками, или MAP2, подтвердили идентичность нейрональных клеток криоконсервированных клеток второго дня. Кроме того, культуры нейронов были обогащены транскриптами тау-белка, связанными с микротрубочками, или MAPT, и показали сопутствующее снижение экспрессии плюрипотентного регулирующего фактора транскрипции POU5F1 Плотная нейритная сеть была сформирована в течение первой недели после оттаивания, что также предполагало увеличение созревания нейрональных культур. Этот протокол закладывает основу для преобразования в крупномасштабные и полностью автоматизированные биореакторы, которые демонстрируют дальнейшее значительное увеличение производительности клеток для будущих крупномасштабных применений.

После того, как это было доказано с нейрогенином 2, использование линейных определяющих факторов транскрипции для ускорения дифференцировки было применено ко многим различным типам клеток и заболеваниям для облегчения моделирования iPSC.