Эффективная васкуляризация органоидов почек путем интраселомной трансплантации куриным эмбрионам
17 февраля 2023 г.
Здесь мы представляем подробный протокол трансплантации органоидов почек в поломическую полость куриных эмбрионов. Этот метод индуцирует васкуляризацию и ускоренное созревание органоидов в течение 8 дней и может быть использован для эффективного изучения этих процессов.
Органоиды почек, культивируемые in vitro, остаются незрелыми, что ограничивает их применимость. А этот метод интрацеломической трансплантации индуцирует васкуляризацию и усиливает созревание органоидов. Процедура очень эффективна, позволяя проводить трансплантацию и анализ большого количества органоидов в одном эксперименте.
После подготовки органоидов почек, полученных из HIPSC, и инкубации оплодотворенные яйца леггорна создают окно в яичной скорлупе на третий день инкубации. Поместите небольшой кусочек прозрачной ленты на заостренный кончик яйца. Сделайте небольшое отверстие в яичной скорлупе посередине прозрачной ленты, постукивая по ней острым концом рассекающих ножниц.
Далее вставьте иглу 19-го калибра на пятимиллилитровом шприце в отверстие под углом 45 градусов. Аспирируйте два-три миллилитра альбумина из яйцеклетки, чтобы опустить эмбрион внутрь яйцеклетки. Скройте отверстие вторым куском прозрачной ленты, затем поместите большой кусок прозрачной ленты на карандаш, отмеченный вверх стороной яйца.
Сделайте отверстие в яичной скорлупе посередине прозрачной ленты, постучав по ней острым концом рассекающих ножниц. Вырежьте из этого отверстия небольшое круглое окошко в яичной скорлупе с помощью изогнутых рассекающих ножниц. Посмотрите в это окно, чтобы найти эмбрион.
Затем увеличьте окно, чтобы оптимизировать доступ к эмбриону. Удалите все большие куски яичной скорлупы, которые могли упасть на эмбрион, с помощью щипцов. Удалите более мелкие кусочки, поместив несколько капель DPBS с кальцием и магнием на эмбрион с помощью пластиковой пипетки для переноса, а затем аспирировав DPBS с яичной скорлупой в пипетку.
С помощью пластиковой пипетки для переноса добавьте в яйцеклетку три капли DPBS, дополненного 0,5% пенициллиновым стрептомицином. Тщательно закройте окно большим куском прозрачной ленты, прежде чем поместить яйцо обратно в инкубатор до четвертого дня инкубации. Отрежьте ленту от окна изогнутыми рассекающими ножницами.
Поместите яйцо под препарирующий микроскоп на резиновый держатель или картонную коробку для яиц. Куриный эмбрион сейчас находится на стадии Гамбургера-Гамильтона с 23 по 24 и лежит на левом боку, а правый бок обращен к зрителю. Найдите правую почку крыла и ноги эмбриона, так как целома будет оцениваться между этими двумя почками конечностей.
В области между правым крылом и почкой ноги последовательно создайте отверстие в вителлинной мембране, хорионе и амнионе, удерживая их двумя парами рассекающих щипцов и осторожно потянув их в противоположных направлениях. Проверьте, есть ли беспрепятственный доступ к целомической полости. Аккуратно возьмитесь за край стенки тела между почкой крыла и лимба парой рассекающих щипцов и слегка потяните его к зрителю.
Целомическая полость должна быть хорошо видна. Осторожно вставьте тупой, но тонкий инструмент в целомическую полость. Поместите половину органоида внутрь яйца поверх аллантоиса с помощью диссектора твердой мозговой оболочки.
С помощью рассекающих щипцов осторожно возьмитесь за край стенки тела и слегка потяните его к зрителю, чтобы было видно отверстие в целом. Осторожно переместите органоид к отверстию в стенке тела и через него в целомум с помощью тупой вольфрамовой проволоки и держателя микроскальпеля. Слегка подтолкните органоид к черепу, чтобы поместить его внутрь целяка.
Теперь он виден сразу за почкой крыла. Добавьте три капли DPBS в яйцо с помощью пластиковой пипетки для переноса. Тщательно закройте окно большим куском прозрачной ленты, прежде чем поместить яйцо обратно в инкубатор до 12 дня инкубации.
Отрежьте ленту от окна изогнутыми рассекающими ножницами. Поместите яйцо под препарирующий микроскоп в резиновый держатель. Оцените сосудистую сеть и найдите вены, которые можно отличить от артерий по их немного более яркому красному цвету.
Чтобы улучшить доступ к сосудистой сети, аккуратно увеличьте окно, разрезав его изогнутыми рассекающими ножницами. Выбрав вену, вставьте кончик иглы микрокапилляра в вену под углом от нуля до 20 градусов. Убедитесь, что игла находится в вене, осторожно перемещая кончик из стороны в сторону.
Осторожно и неуклонно подуйте в систему впрыска, чтобы ввести в линзу culinaris агглютинин. И поместите яйцо обратно в инкубатор на 10 минут, чтобы оно циркулировало. Поместите яйцо в резиновый держатель на скамейке.
Затем прорежьте мембраны, окружающие эмбрион, изогнутыми препарирующими ножницами. Зачерпните эмбрион из яйца перфорированной ложкой и сразу же обезглавьте эмбрион с помощью ножниц. Под диссекционным микроскопом поместите тело эмбриона в чашку Петри.
Поместите эмбрион на спину в чашку Петри и раздвиньте конечности. Аккуратно вскрывают брюшную стенку эмбриона по продольной оси с помощью щипцов. Найдите органоид внутри зародыша.
Органоид чаще всего прикрепляется к правой доле печени, либо на кончике лапки, либо краниально, чуть ниже грудной клетки. Итак, желательно начать с просмотра этих мест. Как только органоид будет найден, удалите его из эмбриона, разрезав его микроножницами.
Поместите органоид в куриную ткань, которая неизбежно прикрепляется к ней, в чашку Петри под препарирующим микроскопом. Удалите как можно больше куриной ткани с помощью обоюдоострого бритвенного лезвия из нержавеющей стали. Иммунофлуоресцентные изображения нетрансплантированного органоида почки и трансплантированного органоида почки содержат клубочковые и канальцевые структуры.
В нетрансплантированных органоидах присутствуют некоторые эндотелиальные клетки человека. В пересаженном органоиде перфузированная сосудистая сеть видна по всему органоиду. Увеличенные изображения коробчатых областей демонстрируют три типа эндотелиальных клеток, которые можно различить в трансплантированных органоидах: перфузированные эндотелиальные клетки человека, неперфузированные эндотелиальные клетки человека и перфузированные эндотелиальные клетки, полученные из курицы.
В нетрансплантированных органоидах эндотелиальные клетки окружают клубочковые структуры, но не вторгаются в них. Однако в трансплантированных органоидах клубочковые структуры васкуляризируются перфузированными капиллярами. Трансплантированные органоиды могут быть проанализированы с использованием различных методов в зависимости от цели эксперимента.
Прямое сравнение с нетрансплантированными контрольными группами может дать представление о процессе васкуляризации и созревания.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол трансплантации органоидов почек в целомную полость эмбрионов цыплят. Этот метод способствует васкуляризации и созреванию органоидов в течение 8 дней, что облегчает эффективное изучение этих процессов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология развития
- Регенерация органов
Теоретические сведения
- Органоиды почек, культивируемые in vitro, часто остаются незрелыми.
- Методы трансплантации могут способствовать развитию органоидов.
- Понимание процессов васкуляризации имеет решающее значение для созревания органоидов.
- В данном исследовании в качестве модели для анализа органоидов используются куриные эмбрионы.
Цель исследования
- Разработать протокол трансплантации органоидов почек.
- Стимулировать васкуляризацию и созревание органоидов.
- Обеспечить возможность эффективного анализа развития органоидов.
Используемые методы
- Подготовка органоидов почек, полученных из HIPSC.
- Инкубация оплодотворенных яиц кур породы Леггорн.
- Создание окна в яичной скорлупе для трансплантации.
- Использование прозрачной клейкой ленты для облегчения процедуры.
Основные результаты
- Успешная трансплантация органоидов почек в эмбрионы цыплят.
- Индукция васкуляризации, наблюдаемая в течение 8 дней.
- Отмечено усиление созревания органоидов после трансплантации.
- Эффективный анализ нескольких органоидов в рамках одного эксперимента.
Выводы
- Метод трансплантации эффективен для созревания органоидов почек.
- Данный подход может быть использован для изучения процессов развития органоидов.
- Перспективы применения включают исследования на основе органоидов в области регенеративной медицины.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Васкуляризация остается критическим препятствием для созревания и трансляционной значимости органоидов почек в моделировании заболеваний и регенеративных исследованиях. Протокол интрацеломической трансплантации в эмбрионы курицы обеспечивает эффективную индукцию перфузируемых сосудов и улучшенное созревание органоидов, напрямую устраняя ключевое ограничение в разработке доклинических моделей. Этот масштабируемый подход позволяет проводить надежный сравнительный анализ и ускоряет оценку систем на основе органоидов для биофармацевтических R&D-циклов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет изучать зависимость созревания органоидов почки человека от васкуляризации.
- Обеспечивает функциональную валидацию нефронподобных структур в условиях перфузии.
- Способствует снижению неопределенности механизмов за счет разграничения вклада перфузируемого и неперфузируемого эндотелия.
Скрининг и разработка методов анализа
- Обеспечивает воспроизводимую систему создания васкуляризированных органоидов, подходящих для последующего анализа.
- Позволяет проводить количественную визуализацию и сравнение степени васкуляризации при различных экспериментальных условиях.
- Способствует стандартизации анализа за счет возможности параллельной трансплантации и анализа нескольких органоидов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Повышает точность моделирования заболеваний за счет воссоздания в органоидах сосудистых сетей, сходных с теми, что наблюдаются in vivo.
- Позволяет проводить прямое сравнение с нетрансплантированным контролем для поиска трансляционных биомаркеров.
- Способствует риск-ориентированному внедрению моделей на основе органоидов в доклинические исследования.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол трансплантации восполняет пробел между культивированием органоидов in vitro и их созреванием в условиях, приближенных к in vivo, что делает его ключевым этапом рабочего процесса — от ранних этапов поиска до квалификации доклинических моделей.
- Открытие в биологии: способствует проверке гипотез о механизмах васкуляризации и созревания в органоидных системах.
- Скрининг: обеспечивает получение стандартизированных васкуляризированных органоидов для сравнительного и количественного анализа.
- Аналитика: позволяет проводить количественную оценку перфузируемых сосудов и интеграции эндотелиальных клеток с помощью методов визуализации.
- Трансляционные исследования: согласовывает созревание органоидов с васкулярными особенностями, характерными для конкретных заболеваний, для повышения преемственности моделей.
- Корпоративное использование: предлагает масштабируемый, совместимый с высокопроизводительным анализом протокол для многократного применения в рамках программ НИОКР.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность моделей заболеваний на основе органоидов, обеспечивая функциональную васкуляризацию.
- Операционная ценность: оптимизирует крупномасштабную трансплантацию и анализ, поддерживая воспроизводимость и масштабируемость.
- Стратегическая ценность: снижает биологические риски за счет создания более физиологически релевантных доклинических моделей.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию активов на основе органоидов с учетом рисков для дальнейшей разработки.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами органоидов, знания в области эмбриологии и владение методами микродиссекции.
- Необходим доступ к платформам визуализации для анализа сосудистой структуры и общего строения.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов трансплантации и визуализации.
- Может потребоваться адаптация метода для различных типов органоидов или моделей разных видов.
- Ограничения включают видоспецифичность интеграции сосудов и техническую вариабельность при трансплантации.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:30
Preparing Chicken Embryos for Transplantation
2:14
Intracelomic Transplantation on Day 4 of Incubation
3:18
Transplantation
4:09
Injection
4:59
Collecting Transplanted Organoids on Day 12 of Incubation
6:12
Results: Analysing the Transplanted Kidney Organoids
7:07
Conclusion
