Мультиплексная иммунофлюоресценция в сочетании с анализом пространственных изображений для клинико-биологической оценки микроокружения опухоли
2 июня 2023 г.
В данной статье описан протокол ручного усиления тирамидного сигнала (TSA) мультиплексной иммунофлуоресценции (mIF) в сочетании с анализом изображений и пространственным анализом. Этот протокол может быть использован с фиксированными формалином парафиновыми срезами (FFPE) для окрашивания от двух до шести антигенов на предметное стекло в зависимости от сканера предметного стекла, доступного в лаборатории.
В нашей лаборатории мы изучаем колоректальный рак человека. Его прогрессирование до метастатического заболевания и его реакция на лечение, включая иммунотерапию. Мы пытаемся найти новые прогностические и прогностические биомаркеры, исследуя иммунное микроокружение опухоли и внутриопухолевый микробиом при первичном и метастатическом заболевании.
В нашем проекте в настоящее время мы внедряем несколько технологий, таких как секвенирование РНК, секвенирование всего экзома, секвенирование TCR, анализ циркулирующей бесклеточной ДНК, иммунофлуоресценция и гибридизация института флуоресценции. На данный момент наша основная задача состоит в том, чтобы объединить гибридизационное окрашивание института флуоресценции с мультиплексной иммунофлуоресценцией амплификации сигнала тирамида для изучения взаимодействия между микробиомом и иммунными клетками. Наш метод надежен, воспроизводим, прост в использовании и экономичен.
Он может быть установлен в любой лаборатории, имеющей сканер флуоресцентного света, плюс метод может быть использован с любым коммерчески доступным антителом IHC в отличие от коммерчески доступных наборов, которые обычно оптимизированы для ограниченной панели антигенов.
Обзор
В этой статье описан протокол для ручного амплификации сигнала тирамидами (TSA) мультиплексной иммунофлуоресценции (mIF) в сочетании с анализом изображений и пространственным анализом. Метод применим к фиксированным в формалине и встроенным в парафин (FFPE) секциям для окрашивания нескольких антигенов на одном слайде.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Иммунология
- Патология
Предпосылки
- Исследование рака толстой кишки человека и его прогрессирование.
- Фокус на иммунной среде опухоли и внутриопухолевом микробиоме.
- Использование различных технологий, включая секвенирование РНК и иммунофлуоресценцию.
- Проблемы в комбинировании различных методов окрашивания для всеобъемлющего анализа.
Цель исследования
- Найти новые предиктивные и прогностические биомаркеры.
- Изучить взаимодействие между микробиомом и иммунными клетками.
- Разработать надежный и воспроизводимый метод окрашивания.
Использованные методы
- Ручная амплификация сигнала тирамидами мультиплексной иммунофлуоресценции.
- Анализ изображений с использованием алгоритмов многокомпонентной флуоресценции.
- Флуоресцентная гибридизация in situ в сочетании с иммунофлуоресценцией.
- Подробный протокол окрашивания для тканевых секций FFPE.
Основные результаты
- Успешное окрашивание нескольких антигенов на одном слайде.
- Оптимизация специфичности антител и соотношения сигнал/шум.
- Эффективный анализ изображений с получением количественных данных.
- Демонстрация применимости метода в различных лабораториях.
Выводы
- Метод TSA mIF является универсальным и экономически эффективным.
- Его можно адаптировать для различных антител и антигенов.
- Этот подход улучшает понимание биологии опухоли.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Multiplex immunofluorescence (mIF) with spatial image analysis enables high-content, quantitative mapping of the tumor microenvironment (TME), supporting biomarker discovery and mechanistic de-risking in oncology pipelines. This workflow provides actionable insights into immune and stromal cell interactions, informing predictive biomarker strategies and translational research. Its reproducibility and compatibility with diverse antibodies position it as a scalable capability for enterprise-level oncology R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables spatially resolved interrogation of immune and tumor cell interactions for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying cell-type densities and proximities within tumor compartments.
- Facilitates identification of novel predictive and prognostic biomarkers for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue systems for downstream multiplexed biomarker screening.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative spatial data for assay development.
- Enables robust evaluation of antibody specificity and signal-to-noise optimization for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial biomarker analysis with disease-relevant models for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by linking TME features to therapeutic response hypotheses.
- Provides quantitative outputs for cross-study and cross-cohort comparisons in preclinical research.
Pipeline & Workflow Integration
This mIF and spatial analysis workflow bridges early discovery, biomarker validation, and translational research in oncology portfolios.
- Discovery Biology: Quantifies immune and stromal cell distributions to clarify TME-driven mechanisms.
- Screening: Standardizes multiplexed tissue assays for reproducible, quantitative readouts.
- Analytics: Exports spatial and density data for statistical comparison of tumor compartments and cell interactions.
- Translational Research: Links spatial biomarker patterns to therapeutic response, supporting preclinical-to-clinical continuity.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any antibody panel and tumor type, enabling broad portfolio application.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in biomarker and target selection by resolving spatial cell interactions.
- Operational Value: Delivers reproducible, scalable, and cost-effective multiplexed tissue analysis.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk through robust TME characterization.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of oncology assets based on spatial biomarker evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, image analysis, and statistical data processing.
- Needs access to a fluorescent slide scanner and compatible image analysis software.
- Demands cross-team standardization of antibody validation and staining protocols.
- Adaptable across tumor types and antibody panels with appropriate optimization.
- Dependent on rigorous antibody specificity and signal-to-noise optimization for reliable outputs.
