Двухэтапная безметная изоляция митохондрий для улучшения обнаружения и количественного определения белка
2 июня 2023 г.
Мы представляем двухэтапный протокол для высококачественного выделения митохондрий, который совместим с открытием и количественной оценкой белка в масштабе протеома. Наш протокол не требует генной инженерии и, таким образом, подходит для изучения митохондрий из любых первичных клеток и тканей.
Наша лаборатория изучает изменения в митохондриях и энергетическом обмене, а также то, как они влияют как на здоровые, так и на патологические процессы, такие как активация иммунитета, рак или нарушения обмена веществ. Наша цель состоит в том, чтобы помочь разработать новые методы лечения широкого спектра заболеваний, обеспечивая лучшее понимание функции митохондрий и энергетического обмена. Такие инструменты, как протеомика на основе масс-спектрометрии, метаболомика и генетические скрининги CRISPR-Cas9, становятся все более популярными для выявления молекулярных механизмов как в функции митохондрий, так и в энергетическом метаболизме в определенных типах клеток и средах.
В отличие от других методов, в нашем протоколе используются два этапа очистки: дифференциальное центрифугирование и иммунный захват для выделения митохондрий. Это дает несколько преимуществ, таких как улучшенное удаление загрязняющих веществ, а также является мощным инструментом для идентификации новых митохондриальных белков. Наш протокол дает представление о составе и, следовательно, о функции митохондрий в различных типах клеток и средах.
Это может помочь нам лучше понять нормальные процессы, такие как активация иммунитета, а также патологические процессы, такие как рак. Мы сосредоточимся на митохондриальных макрофагах. Мы проверим, как меняется состав митохондрий во время иммунного ответа, чтобы лучше понять их функцию.
Наши результаты могут привести к разработке лекарств, например, с противовоспалительным действием.
Обзор
В данном исследовании представлен двухэтапный протокол высококачественного выделения митохондрий, направленный на углубление понимания функций митохондрий и энергетического метаболизма в различных биологических контекстах, включая иммунную активацию и рак. Совместимость метода с первичными клетками и тканями позволяет расширить область его применения для поиска и количественного определения белков.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Функция митохондрий
- Энергетический обмен
- Патологические процессы, такие как рак и иммунная активация
Теоретические сведения
- Исследование того, как митохондриальные изменения влияют на здоровье и развитие заболеваний
- Разработка терапевтических стратегий на основе углубленного понимания молекулярных механизмов
- Использование масс-спектрометрии и других инструментов для протеомного анализа
Используемые методы
- Двухэтапный протокол очистки с использованием дифференциального центрифугирования и иммунозахвата
- Первичные клетки и ткани для выделения митохондрий
- Технологии протеомики и метаболомики
Основные результаты
- Улучшенная очистка митохондрий, позволяющая более точно идентифицировать митохондриальные белки
- Представления о составе митохондрий, влияющем на иммунные ответы
- Потенциальное значение для разработки таргетных лекарственных препаратов, например, противовоспалительных средств
Выводы
- В исследовании разработан новый протокол анализа митохондрий без генетических манипуляций
- Результаты имеют важное значение для понимания и лечения различных заболеваний, связанных с митохондриальной дисфункцией
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Высокоточное выделение митохондрий имеет критическое значение для достоверного обнаружения и количественного определения белков в системах, релевантных для изучения заболеваний. Данный двухэтапный протокол без использования меток позволяет проводить надежную характеристику митохондриальных протеомов из первичных клеток и тканей, что повышает прогностическую уверенность на ранних этапах поиска и в трансляционных исследованиях. Повышенная чистота и результаты количественной масс-спектрометрии напрямую способствуют валидации мишеней и снижению механистических рисков в различных терапевтических областях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать состав митохондриальных белков при патологических и физиологических состояниях.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней за счет выделения органелл с минимальным количеством примесей.
- Способствует снижению механистических рисков с помощью субтрактивной протеомики и количественного анализа.
- Повышает прогностическую достоверность для митохондриальных мишеней при отборе объектов портфеля.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение высококачественных препаратов митохондрий для последующего протеомного анализа.
- Стандартизирует исходный материал для проведения воспроизводимых количественных масс-спектрометрических анализов.
- Позволяет надежно обнаруживать новые митохондриальные белки в ходе скрининговых кампаний.
- Обеспечивает масштабируемость и возможность повторного использования платформы для различных клеточных линий, первичных клеток и тканей.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет профили митохондриальных белков с моделями соответствующих заболеваний и поиском биомаркеров.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации за счет возможности проведения межсистемных сравнений.
- Снижает биологические риски в трансляционных исследованиях, обеспечивая комплексную характеристику органелл.
- Поддерживает принятие решений о дальнейшем продвижении проекта с учетом рисков на основе количественных протеомных данных.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный протокол интегрируется в процесс исследований — от начальной проверки гипотез до идентификации перспективных соединений и доклинических исследований, обеспечивая надежный анализ митохондрий на каждом этапе.
- Открытия в биологии: способствует проверке гипотез и уточнению путей метаболизма, обеспечивая точное профилирование митохондриальных белков.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты для разработки методов анализа и оценки соединений.
- Аналитика: предоставляет измерения на основе масс-спектрометрии и расчеты обогащения для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: облегчает согласование биомаркеров и валидацию моделей заболеваний с помощью органеллярной протеомики.
- Корпоративное повторное использование: предлагает стандартизированный рабочий процесс без использования меток, который можно адаптировать для различных биологических систем и исследовательских программ.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования и устраняет неопределенность в механизмах при исследовании митохондрий.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость методов выделения и анализа митохондрий.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет предоставления высококачественных данных для валидации мишеней.
- Влияние на портфель: обеспечивает приоритизацию и продвижение митохондриальных мишеней и путей с учетом скорректированных рисков.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт в области выделения органелл и количественной масс-спектрометрии.
- Необходим доступ к центрифугам и инфраструктуре для протеомных исследований.
- Рекомендуется межкомандная стандартизация процессов подготовки образцов и анализа данных.
- Метод применим к различным типам клеток и тканей без необходимости генетической модификации.
- Результат зависит от тщательной оптимизации для минимизации загрязнений и максимизации выхода продукта.
