Высокоэффективное разрушение генов в первичных макрофагах костного мозга с использованием электропорированных комплексов Cas9-sgRNA
4 августа 2023 г.
Данный протокол описывает процедуру редактирования генома макрофагов костного мозга мышей с использованием рибонуклеопротеидных комплексов Cas9-sgRNA, собранных in vitro и доставленных методом электропорации.
Наша лаборатория изучает взаимодействие между микобактериями, туберкулезом и иммунной системой хозяина, уделяя особое внимание первоначальному взаимодействию между бактерией и макрофагом. Существует множество методов разрушения генов, используемых в макрофагах, включая технологии РНК-интерференции и технологии CRISPR. Одной из основных проблем является низкая эффективность разрушения генов в макрофагах.
Этот протокол позволяет быстро и эффективно манипулировать первичными макрофагами без необходимости клонирования и конструирования плазмид. Эти методы должны быть широко применимы в иммунологии, позволяя исследователям разрушать гены в первичных макрофагах для широкого спектра исследований.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан метод редактирования генома в макрофагах, полученных из костного мозга мыши, с использованием рибонуклеопротеиновых комплексов Cas9-sgRNA. Этот подход повышает эффективность генетических манипуляций в первичных макрофагах.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Генная инженерия
- Биология макрофагов
Теоретическая часть
- Макрофаги играют ключевую роль в иммунном ответе.
- Методы нарушения функции генов жизненно важны для изучения функций макрофагов.
- Традиционные методы часто характеризуются низкой эффективностью.
- Данный протокол решает эти проблемы, обеспечивая высокую эффективность генетических манипуляций.
Цель исследования
- Для повышения эффективности нокаута генов в первичных макрофагах.
- Для обеспечения возможности быстрого генетического манипулирования без клонирования.
- Для предоставления метода, применимого в различных иммунологических исследованиях.
Используемые методы
- Сборка рибонуклеопротеиновых комплексов Cas9-sgRNA in vitro.
- Доставка этих комплексов посредством электропорации.
- Установка специфических параметров электропорации (например, 1,900 volts, 20 milliseconds).
- Применение на первичных макрофагах костного мозга мыши.
Основные результаты
- Продемонстрирована высокая эффективность нокаута генов в макрофагах.
- Обеспечена возможность быстрого генетического манипулирования без необходимости использования плазмид.
- Показана широкая применимость для различных иммунологических исследований.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод генетических манипуляций в макрофагах.
- В нем решаются проблемы, возникшие ранее с эффективностью разрыва генов.
- Исследователи могут использовать этот метод для различных исследований в области иммунологии.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Эффективный нокаут генов в первичных макрофагах, полученных из костного мозга (BMDM), устраняет критическое узкое место в разработке иммунологических препаратов, обеспечивая быстрое и достоверное функциональное исследование генома в релевантных для заболевания первичных клетках. Высокая эффективность редактирования и оптимизированный рабочий процесс данного протокола обеспечивают надежную валидацию мишеней и снижение механистических рисков на ранних этапах разработки. Данный подход повышает прогностическую достоверность при отборе портфеля препаратов и ускоряет трансляцию генетических данных в практически применимые терапевтические гипотезы.
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет напрямую исследовать функцию генов в первичных макрофагах, что способствует снижению рисков при изучении механизмов.
- Облегчает быструю валидацию терапевтических мишеней в физиологически релевантной системе.
- Обеспечивает высокую достоверность исследований потери функции для уточнения сигнальных путей.
- Повышает прогностическую ценность для принятия последующих решений по портфелю препаратов.
Скрининг и разработка анализа
- Подготавливает валидированные системы первичных клеток для последующего фенотипического скрининга.
- Обеспечивает воспроизводимые количественные результаты нарушений функций генов для стандартизации анализа.
- Позволяет реализовать масштабируемые рабочие процессы без использования плазмид, подходящие для итерационных кампаний скрининга.
- Обеспечивает надежную оценку воздействия соединений на отредактированные макрофаги.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает соответствие генетических манипуляций биологии макрофагов при соответствующих заболеваниях для обеспечения трансляционной преемственности.
- Способствует разработке доклинических моделей с использованием первичных клеток с определенным генетическим редактированием.
- Снижает биологический риск, связывая этап открытия и доклиническую валидацию в первичных системах.
- Поддерживает поиск биомаркеров и механистические исследования в рамках иммунологических разработок.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный рабочий процесс CRISPR на основе электропорации интегрируется на ранних этапах поиска и валидации мишеней, обеспечивая плавный переход к идентификации ведущих соединений и доклиническим исследованиям в рамках конвейеров, ориентированных на иммунологию.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез и анализ путей в первичных макрофагах.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимое количественное нарушение экспрессии генов для подготовки анализа.
- Аналитика: позволяет измерять эффективность редактирования с помощью секвенирования по Сэнгеру для сравнения условий.
- Трансляционные исследования: сохраняет релевантность заболеванию за счет использования первичных клеток для генетических исследований.
- Корпоративное использование: предлагает стандартизированный, широко применимый протокол генетических манипуляций для иммунологических проектов.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования и снижает неопределенность механизмов при валидации мишеней.
- Операционная ценность: оптимизирует рабочие процессы, обеспечивая высокую эффективность, воспроизводимость и отсутствие необходимости в конструировании плазмид.
- Стратегическая ценность: позволяет быстрее принимать решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективно распределять капитальные ресурсы.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков и продвижению активов в области иммунологии.
Особенности внедрения
- Требуется опыт работы с первичными клетками и сборкой РНП-комплексов CRISPR.
- Необходим доступ к оборудованию для электропорации и инфраструктуре для секвенирования по Сенгеру.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости в многоцентровых исследованиях.
- Может потребоваться адаптация протокола для других типов первичных клеток или видов.
- Эффективность редактирования и жизнеспособность клеток должны быть эмпирически подтверждены для каждой целевой гена.
