Высокоэффективное разрушение генов в первичных макрофагах костного мозга с использованием электропорированных комплексов Cas9-sgRNA
4 августа 2023 г.
Данный протокол описывает процедуру редактирования генома макрофагов костного мозга мышей с использованием рибонуклеопротеидных комплексов Cas9-sgRNA, собранных in vitro и доставленных методом электропорации.
Наша лаборатория изучает взаимодействие между микобактериями, туберкулезом и иммунной системой хозяина, уделяя особое внимание первоначальному взаимодействию между бактерией и макрофагом. Существует множество методов разрушения генов, используемых в макрофагах, включая технологии РНК-интерференции и технологии CRISPR. Одной из основных проблем является низкая эффективность разрушения генов в макрофагах.
Этот протокол позволяет быстро и эффективно манипулировать первичными макрофагами без необходимости клонирования и конструирования плазмид. Эти методы должны быть широко применимы в иммунологии, позволяя исследователям разрушать гены в первичных макрофагах для широкого спектра исследований.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан метод редактирования генома макрофагов, полученных из костного мозга мыши, с использованием рибонуклеопротеиновых комплексов Cas9-sgRNA. Этот подход повышает эффективность генетических манипуляций в первичных макрофагах.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Генная инженерия
- Биология макрофагов
Теоретическая база
- Макрофаги играют важнейшую роль в иммунном ответе.
- Методы делеции генов имеют жизненно важное значение для изучения функций макрофагов.
- Традиционные методы часто характеризуются низкой эффективностью.
- Данный протокол решает эти проблемы, обеспечивая высокоэффективную генетическую манипуляцию.
Цель исследования
- Повышение эффективности разрыва гена в первичных макрофагах.
- Обеспечение возможности быстрого генетического манипулирования без клонирования.
- Предоставление метода, применимого для различных иммунологических исследований.
Используемые методы
- Сборка рибонуклеопротеиновых комплексов Cas9-sgRNA in vitro.
- Доставка этих комплексов методом электропорации.
- Установка специфических параметров электропорации (например, 1,900 вольт, 20 миллисекунд).
- Применение на первичных макрофагах, полученных из костного мозга мыши.
Основные результаты
- Продемонстрирована высокая эффективность нокаута генов в макрофагах.
- Обеспечена возможность быстрого генетического манипулирования без использования плазмид.
- Показана широкая применимость для различных иммунологических исследований.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод генетических манипуляций в макрофагах.
- В нем решаются проблемы, возникавшие ранее с эффективностью разрыва генов.
- Исследователи могут использовать этот метод для различных исследований в области иммунологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Эффективная деструкция генов в первичных макрофагах, полученных из костного мозга (BMDMs), устраняет критический барьер в разработке лекарственных препаратов для иммунологии, обеспечивая быстрое и высокоточное функциональное исследование генома в первичных клетках, имеющих значение для патологии. Высокая эффективность редактирования и оптимизированный рабочий процесс данного протокола способствуют надежной валидации мишеней и снижению механистических рисков на ранних этапах поиска. Этот подход повышает прогностическую уверенность при отборе кандидатов для портфеля и ускоряет трансляцию генетических данных в практически применимые терапевтические гипотезы.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую исследовать функцию генов в первичных макрофагах, что способствует снижению рисков при изучении механизмов действия.
- Обеспечивает быструю валидацию терапевтических мишеней в физиологически релевантной системе.
- Позволяет с высокой степенью достоверности проводить исследования потери функции для уточнения сигнальных путей.
- Повышает прогностическую ценность для принятия последующих решений по формированию портфеля препаратов.
Скрининг и разработка методов анализа
- Подготовка валидированных систем первичных клеток для последующего фенотипического скрининга.
- Обеспечение воспроизводимых количественных результатов нарушений функций генов для стандартизации анализа.
- Возможность использования масштабируемых рабочих процессов без применения плазмид, подходящих для итерационных кампаний по скринингу.
- Поддержка надежной оценки воздействия соединений в отредактированных макрофагах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает соответствие генетических манипуляций биологии макрофагов при соответствующих заболеваниях для обеспечения трансляционной преемственности.
- Способствует разработке доклинических моделей с использованием первичных клеток с определенными генетическими модификациями.
- Снижает биологические риски за счет создания связующего звена между этапами поиска и доклинической валидации в первичных системах.
- Поддерживает поиск биомаркеров и проведение механистических исследований в рамках иммунологических разработок.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный рабочий процесс CRISPR на основе электропорации интегрируется на ранних этапах поиска и валидации мишеней, обеспечивая плавный переход к идентификации ведущих соединений и доклиническим исследованиям в рамках конвейеров, ориентированных на иммунологию.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез и анализ сигнальных путей в первичных макрофагах.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимое количественное нарушение функций генов для подготовки к проведению анализов.
- Аналитика: позволяет измерять эффективность редактирования с помощью секвенирования по Сэнгеру для сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: сохраняет значимость для изучения заболеваний за счет использования первичных клеток в генетических исследованиях.
- Корпоративное использование: предлагает стандартизированный, широко применимый протокол генетических манипуляций для различных иммунологических проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неоднозначность при валидации мишени.
- Операционная ценность: оптимизирует рабочие процессы за счет высокой эффективности, воспроизводимости и отсутствия необходимости конструирования плазмид.
- Стратегическая ценность: позволяет быстрее принимать решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективно распределять ресурсы.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков и продвижению разработок в области иммунологии.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с первичными клетками и сборки РНП-комплексов CRISPR.
- Необходим доступ к оборудованию для электропорации и инфраструктуре для секвенирования по Сэнгеру.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости в многоцентровых исследованиях.
- Может потребоваться адаптация протокола для других видов или типов первичных клеток.
- Эффективность редактирования и жизнеспособность клеток должны быть эмпирически подтверждены для каждой целевой последовательности гена.
