Анализ трансгенерационного эпигенетического наследования C. elegans с использованием флуоресцентного репортера и хроматиновой иммунопреципитации (ChIP)
5 мая 2023 г.
В этом протоколе описывается РНК-интерференция и анализ ChIP для изучения эпигенетического наследования РНК-индуцированного сайленсинга и связанных с ним модификаций хроматина у C. elegans.
Исследования, проводимые в нашей лаборатории, изучают, как хроматин-ассоциированные белки, модификации гистонов и факторы пути малой РНК работают вместе в контексте развития и трансгенерационного эпигенетического наследования. Анализ наследования РНК с использованием репортера GFP стал очень мощным инструментом. В этом протоколе описывается, как стандартизировать подготовку, подсчет баллов и пассаж червей, а также подготовку образцов ChIP, что может помочь получить воспроизводимые результаты.
Одной из экспериментальных задач при изучении трансгенов, экспрессируемых зародышевой линией, является выделение эффектов в зародышевой линии животного. В настоящее время мы используем целых животных для ChIP, но в будущем мы хотели бы разработать тесты для изучения хроматина, особенно в зародышевой линии. Наша лаборатория интересуется метилированием гистонов и белками, которые распознают эти метки.
В дальнейшем мы хотели бы исследовать взаимодействие между этими считывателями хроматина и малыми путями РНК в контексте наследования РНК-интерференции в трансгенах и регуляции эндогенных последовательностей.
Обзор
В данном протоколе описываются методы РНК-интерференции и ChIP-анализа для исследования эпигенетического наследования сайленсинга, индуцированного РНК-интерференцией, и модификаций хроматина у C. elegans.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Эпигенетика
- Молекулярная биология
Теоретическая часть
- Исследования сосредоточены на белках, ассоциированных с хроматином, и модификациях гистонов.
- Пути малых РНК играют решающую роль в развитии и наследовании.
- Для анализа наследования РНК используется GFP-репортер, обеспечивающий эффективность исследования.
- К трудностям относится изоляция эффектов зародышевой линии в трансгенах.
Цель исследования
- Стандартизировать подготовку и оценку C. elegans для анализов наследования РНК-интерференции.
- Исследовать взаимодействие между ридерами хроматина и путями малых РНК.
- Изучить механизмы трансгенерационного эпигенетического наследования.
Используемые методы
- Подготовка эмбрионов C. elegans с использованием отбеливающего раствора.
- РНК-интерференция с использованием векторов GFP или контрольных векторов на агаризованных средах.
- Оценка экспрессии GFP в различных поколениях.
- Сшивание формальдегидом для проведения ChIP-анализа.
Основные результаты
- Сайленсинг трансгена был полностью пенетрантным в поколениях P0 и F1.
- В поколении F2 наблюдалось наследование сайленсинга GFP примерно у 50% потомства.
- К поколению F5 большинство червей не демонстрировали наследования сайленсинга.
- К поколению F10 все черви экспрессировали GFP, что указывает на потерю наследования.
Выводы
- Данное исследование позволяет расширить представления о наследовании РНК-интерференции и модификациях хроматина.
- Стандартизированные методы повышают воспроизводимость в эпигенетических исследованиях.
- Будущая работа будет сосредоточена на анализе хроматина специфичного для зародышевого пути.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Трансгенерационное эпигенетическое наследование (TEI) у C. elegans представляет собой надежную модель для изучения механизмов наследуемой регуляции генов без изменений в последовательности ДНК. Интеграция анализа с использованием флуоресцентных репортеров и метода ChIP-qPCR позволяет проводить количественный анализ модификаций хроматина и сайленсинга, индуцированного РНК-интерференцией, с разделением по поколениям. Данный рабочий процесс обеспечивает прогностическую достоверность при валидации мишеней и снижении механистических рисков на ранних этапах поиска.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую изучать механизмы наследуемого сайленсинга генов, имеющие значение для валидации мишеней.
- Способствует снижению механистических рисков путем установления связи между модификациями хроматина и функциональными результатами экспрессии генов.
- Облегчает сортировку портфеля проектов, предоставляя количественные данные об эпигенетической регуляции с разрешением по поколениям.
Скрининг и разработка анализа
- Создает валидированные, воспроизводимые биологические системы для последующего скрининга модуляторов хроматина и путей РНК-интерференции.
- Стандартизирует количественную оценку сайленсинга репортера и обогащения модификаций гистонов.
- Обеспечивает масштабируемые многопоколенческие форматы анализа для оценки соединений и изучения путей передачи сигнала.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует эпигенетическим механизмам, связанным с заболеванием, за счет моделирования наследуемых изменений хроматина.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа поиска до доклинической валидации эпигенетических мишеней и путей.
- Поддерживает принятие решений о продвижении проекта с учетом рисков путем количественной оценки устойчивости и обратимости сайленсинга генов.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод связывает этап ранних открытий с доклиническими исследованиями, позволяя проверять гипотезы об эпигенетическом наследовании и динамике хроматина в ряду поколений.
- Открывающая биология: количественная оценка влияния РНКи и модификаций хроматина на наследуемую регуляцию генов.
- Скрининг: получение воспроизводимых количественных данных о сайленсинге репортеров и обогащении метками гистонов.
- Аналитика: статистическое сравнение устойчивости сайленсинга и состояния хроматина в разных поколениях.
- Трансляционные исследования: моделирование эпигенетических механизмов, имеющих значение для заболеваний и терапевтического вмешательства.
- Корпоративное использование: модульная платформа, адаптируемая к различным генным мишеням и путям модификации хроматина.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования при валидации мишеней и снижает механистическую неопределенность в эпигенетической регуляции.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость многопоколенческих анализов.
- Стратегическая ценность: служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и распределения капитала за счет количественной оценки динамики наследуемого сайленсинга.
- Влияние на портфель: обеспечивает приоритезацию эпигенетических мишеней и путей для дальнейшего продвижения с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с C. elegans, методы РНК-интерференции (RNAi) и иммунопреципитации хроматина.
- Необходим доступ к флуоресцентной микроскопии и оборудованию для количественной ПЦР (qPCR) для получения количественных данных.
- Требуется стандартизация протоколов оценки и подготовки образцов между исследовательскими группами.
- Метод может быть адаптирован для различных репортерных конструкций и меток хроматина путем модификации протокола.
- Проведение ChIP на целом животном может ограничить специфичность по отношению к зародышевой линии; будущие модификации могут быть направлены на устранение этого ограничения.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:17
Bleaching and Plating Caenorhabditis elegans P0 Generation Embryos onto RNAi-NGM plates
3:47
Passaging and Scoring the Caenorhabditis elegans P0 Generation for Germline GFP Expression
5:42
Collection of F1 Generation Caenorhabditis elegans for Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)
6:38
Formaldehyde Crosslinking of the F1 Generation of Caenorhabditis elegans for ChIP
7:50
Sonication of Formaldehyde-Crosslinked Caenorhabditis elegans and Chromatin Immunoprecipitation
