Анализ трансгенерационного эпигенетического наследования C. elegans с использованием флуоресцентного репортера и хроматиновой иммунопреципитации (ChIP)
5 мая 2023 г.
В этом протоколе описывается РНК-интерференция и анализ ChIP для изучения эпигенетического наследования РНК-индуцированного сайленсинга и связанных с ним модификаций хроматина у C. elegans.
Исследования, проводимые в нашей лаборатории, изучают, как хроматин-ассоциированные белки, модификации гистонов и факторы пути малой РНК работают вместе в контексте развития и трансгенерационного эпигенетического наследования. Анализ наследования РНК с использованием репортера GFP стал очень мощным инструментом. В этом протоколе описывается, как стандартизировать подготовку, подсчет баллов и пассаж червей, а также подготовку образцов ChIP, что может помочь получить воспроизводимые результаты.
Одной из экспериментальных задач при изучении трансгенов, экспрессируемых зародышевой линией, является выделение эффектов в зародышевой линии животного. В настоящее время мы используем целых животных для ChIP, но в будущем мы хотели бы разработать тесты для изучения хроматина, особенно в зародышевой линии. Наша лаборатория интересуется метилированием гистонов и белками, которые распознают эти метки.
В дальнейшем мы хотели бы исследовать взаимодействие между этими считывателями хроматина и малыми путями РНК в контексте наследования РНК-интерференции в трансгенах и регуляции эндогенных последовательностей.
Обзор
В данном протоколе описывается метод РНК-интерференции и анализ иммунопреципитации хроматина (ChIP) для изучения эпигенетического наследования сайленсинга, индуцированного РНК-интерференцией, и модификаций хроматина у C. elegans.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Эпигенетика
- Молекулярная биология
Теоретическая часть
- Исследования сосредоточены на белках, ассоциированных с хроматином, и модификациях гистонов.
- Пути малых РНК играют решающую роль в развитии и наследовании.
- В анализе наследования РНК для эффективного анализа используется GFP-репортер.
- Трудности включают изоляцию эффектов зародышевой линии в трансгенах.
Цель исследования
- Стандартизировать подготовку и оценку C. elegans для анализа наследования РНК-интерференции.
- Изучить взаимодействие между считывателями хроматина и путями малых РНК.
- Изучить механизмы трансгенерационного эпигенетического наследования.
Используемые методы
- Подготовка эмбрионов C. elegans с использованием отбеливающего раствора.
- РНК-интерференция с использованием векторов GFP или контрольных векторов на агариковых пластинках.
- Оценка экспрессии GFP в различных поколениях.
- Сшивание формальдегидом для проведения ChIP-анализа.
Основные результаты
- Сайленсинг трансгена был полностью пенетрантным в поколениях P0 и F1.
- В поколении F2 наблюдалось наследование сайленсинга GFP примерно у 50% потомства.
- К поколению F5 у большинства червей наследование сайленсинга отсутствовало.
- К поколению F10 все черви экспрессировали GFP, что указывает на утрату наследования.
Выводы
- Данное исследование позволяет лучше понять механизмы наследования РНК-интерференции и модификации хроматина.
- Стандартизированные методы повышают воспроизводимость эпигенетических исследований.
- Будущая работа будет сосредоточена на анализе хроматина специфичного для зародышевой линии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Трансгенерационное эпигенетическое наследование (TEI) у C. elegans представляет собой надежную модель для изучения механизмов наследуемой регуляции генов без изменений в последовательности ДНК. Интеграция анализов с флуоресцентными репортерами и метода ChIP-qPCR позволяет проводить количественный анализ модификаций хроматина и сайленсинга, индуцированного РНК-интерференцией, с разделением по поколениям. Данный рабочий процесс обеспечивает прогностическую уверенность при валидации мишеней и снижении механистических рисков на ранних этапах поиска.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую исследовать механизмы наследуемого сайленсинга генов, что имеет важное значение для валидации мишеней.
- Способствует механистическому снижению рисков путем установления связи между модификациями хроматина и функциональными результатами экспрессии генов.
- Облегчает приоритизацию портфеля проектов, обеспечивая количественные показатели эпигенетической регуляции с разрешением по поколениям.
Скрининг и разработка анализа
- Создает валидированные, воспроизводимые биологические системы для последующего скрининга модуляторов хроматина и пути РНК-интерференции.
- Стандартизирует количественную оценку сайленсинга репортера и обогащения модификациями гистонов.
- Обеспечивает масштабируемые форматы многопоколенческого анализа для оценки соединений и исследования путей передачи сигнала.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует эпигенетическим механизмам, связанным с заболеванием, путем моделирования наследуемых изменений хроматина.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации эпигенетических мишеней и путей.
- Поддерживает принятие решений о продвижении проекта с учетом рисков путем количественной оценки устойчивости и обратимости сайленсинга генов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод связывает этапы ранних открытий и доклинических исследований, позволяя проверять гипотезы об эпигенетическом наследовании и динамике хроматина в разных поколениях.
- Биологические исследования: Количественная оценка влияния РНК-интерференции и модификаций хроматина на наследуемую регуляцию генов.
- Скрининг: Обеспечение воспроизводимых количественных результатов при подавлении экспрессии репортерных генов и обогащении гистоновыми метками.
- Аналитика: Статистическое сравнение устойчивости сайленсинга и состояния хроматина в разных поколениях.
- Трансляционные исследования: Моделирование эпигенетических механизмов, имеющих значение для патологий и терапевтического вмешательства.
- Применение в масштабе предприятия: Предоставление модульной платформы, адаптируемой под различные генные мишени и пути модификации хроматина.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность валидации мишеней и снижает неопределенность механизмов эпигенетической регуляции.
- Операционная ценность: Улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость многопоколенческих анализов.
- Стратегическая ценность: Обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и распределение капитала путем количественной оценки динамики наследуемого сайленсинга.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию эпигенетических мишеней и путей с учетом рисков для дальнейшего продвижения.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с C. elegans, методами РНК-интерференции (RNAi) и иммунопреципитации хроматина.
- Необходим доступ к флуоресцентной микроскопии и оборудованию для количественной ПЦР (qPCR) для получения количественных данных.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов оценки и подготовки образцов.
- Метод может быть адаптирован для различных репортерных конструкций и модификаций хроматина путем корректировки протокола.
- Проведение ChIP на всем организме может ограничить специфичность по отношению к зародышевой линии; будущие модификации могут устранить этот недостаток.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:17
Bleaching and Plating Caenorhabditis elegans P0 Generation Embryos onto RNAi-NGM plates
3:47
Passaging and Scoring the Caenorhabditis elegans P0 Generation for Germline GFP Expression
5:42
Collection of F1 Generation Caenorhabditis elegans for Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)
6:38
Formaldehyde Crosslinking of the F1 Generation of Caenorhabditis elegans for ChIP
7:50
Sonication of Formaldehyde-Crosslinked Caenorhabditis elegans and Chromatin Immunoprecipitation
