Name: Эффективная быстрая перфузия крови у Xenopus (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-16T12:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Узнайте метод быстрой перфузии крови у Xenopus laevis и Xenopus tropicalis для транскриптомики и протеомики. Этот протокол обеспечивает гуманное обращение и высокое качество образцов тканей.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Эта работа была поддержана грантом NIH OD R24 OD031956 и грантом NICHD R01 HD073104. Мы благодарим Дарси Келли за полезные обсуждения и первоначальный вклад в этот протокол. Мы также хотели бы поблагодарить Саманту Джалберт, Джилл Ралстон и Уила Ратцана за их помощь и поддержку, а также трех наших анонимных рецензентов за их отзывы.

Все эксперименты проводились в соответствии с правилами и положениями Гарвардской медицинской школы IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя основной метод эвтаназии, описанный Американской ветеринарной медицинской ассоциацией, считается приемлемым методом эвтаназии12, не было обнаружено, что он приводит к прекращению сердцебиения13. Даже часто используемый вторичный метод двойной порки не предотвращает этого, равно как и удаление сердца у животного. Обескровливание животных, находящихся под наркозом, считается гуманным и эффективным методом успешной эвтаназии12. Поскольку поддержание свежих тканей посредством эвтаназии является целью этого протокола, полезно, чтобы сердце продолжало биться во время первичной эвтаназии с MS-222, и что перфузия сама по себе является методом вторичной эвтаназии путем обескровливания.
1. Подготовка
<ol><li>Убедитесь, что научно-исследовательское учреждение одобрило метод эвтаназии и перфузии, описанный в этом протоколе.</li>
	<li>Приготовьте раствор из 5 г/л MS-222 (трикаинметансульфоната) и 5 г/л бикарбоната натрия. Объем должен быть больше, чем объем, необходимый для полного покрытия усыпляемых животных. Проверьте рН, чтобы убедиться, что он составляет ≥7.</li>
	<li>Приготовьте 500 мкл 180 ЕД/мл гепарина в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) на X . laevis или 200 мкл на X. tropicalis.</li>
	<li>Проведите первичную эвтаназию, поместив Xenopus в этот раствор (из шага 1.2); Животное будет оставаться под водой в общей сложности 1 час.</li>
	<li>Подтвердите, что Xenopus потерял свою болевую реакцию, ущипнув ногу через 15 минут после эвтаназии. Если животное реагирует, верните его в раствор для эвтаназии до тех пор, пока этот ответ не будет потерян.</li>
	<li>Взвесьте Xenopus и проведите любые дополнительные измерения, необходимые перед отбором проб.</li>
	<li>Используя иглу весом 31 г, введите X. laevis 250 мкл и X. tropicalis 100 мкл гепарина 180 ЕД/мл в PBS (с шага 1.3) в мускулатуру каждой передней конечности.</li>
	<li>Готовят раствор 1 мл/г животного массой 54 ЕД/мл гепарина в перфузате PBS. Люди, более опытные с этим протоколом, могут обнаружить, что для полной перфузии требуется меньше среды.</li>
	<li>Используйте иглу для подкожных инъекций 22 г для перфузии X. laevis и иглу для подкожных инъекций 25 г для X. tropicali s. Затупите перфузионную иглу, обрезав кончик кусачками (рис. 1)14. ПРИМЕЧАНИЕ: Это снижает вероятность перфорации иглы через желудочек при смещении. В дополнение к притуплению, игла может быть слегка отшлифована точильным камнем или напильником, но все же остается достаточно острой, чтобы проткнуть желудочек.</li>
	<li>Подготовьте насос, присоединив обрезанную иглу и циркулируя гепаринизированный перфузат PBS 54 ЕД/мл (из шага 1.8). Убедитесь, что все пузырьки воздуха удалены из трубки, чтобы исключить возможность воздушной эмболии, которая приводит к снижению эффективности перфузии или отказу (см. Таблицу 1). Держите перфузионную среду на льду в течение всей процедуры.</li>
	<li>Если насос не программируется, с установленной иглой измерьте объем перекачиваемой среды при различных настройках, чтобы определить, какие настройки наиболее близки к 5 мл/мин и 10 мл/мин. Эти скорости потока будут использоваться независимо от вида. Если перфузионный насос является программируемым, откалибруйте его с установленной иглой, следуя инструкциям производителя.</li>
	<li>Поместите поверхность для вскрытия (лоток или лист пенопласта) под наклоном во вторичный контейнер или расположите ее так, чтобы облегчить дренаж крови.</li>
	<li>После того, как лягушка находилась в растворе в течение 1 часа, первичная эвтаназия была завершена. Извлеките лягушку и еще раз проверьте потерю болевой реакции, выполнив ущипывание ногой.</li>
	<li>Положите лягушку на спину и прижмите каждую конечность (рисунок 2). Если требуется сохранение тканей конечностей, тонкие штифты могут быть помещены через пальцы или U-образные скобы вокруг конечностей.</li>
	<li>С помощью ножниц для рассечения прорежьте кожу, вверх по средней линии, а затем сбоку, сделав два лоскута. (Рисунок 2)</li>
	<li>Используйте щипцы, чтобы захватить белую линию и вытащить ее из целомической полости (рис. 3). Аккуратно используйте ножницы, чтобы разрезать мускулатуру. Сделайте две створки из стенки полости и отрежьте или закрепите все створки в стороне.</li>
	<li>Используйте ножницы для рассечения, чтобы разрезать коракоидные кости и срезать лишнюю ткань, чтобы получить лучший доступ к сердцу (рис. 3).</li>
	<li>Сердце все еще должно биться. Если сердце перестало биться до перфузии, обратите внимание, что свежесть образца была нарушена.</li>
</ol>2. Перфузия
<ol><li>Определите желудок и аккуратно сдвиньте его так, чтобы он находился поверх левой доли печени (справа от зрителя), при этом его сосудистая сеть была видна на протяжении всей процедуры. Определите легкое и захватите его за кончик с помощью тканевых щипцов. Вытяните легкое за пределы целомической полости и проткните его через наконечник (рис. 4). Делайте это осторожно, так как лопнувшие кровеносные сосуды плохо перфузируются. Обратите внимание, видна ли кровь в доле, так как это повлияет на способность определить завершение процедуры.</li>
	<li>Сделайте снимок целомической полости, чтобы лучше оценить эффективность перфузии и потенциально идентифицировать аномальные ткани на более позднем этапе.</li>
	<li>Определите тонкий перикард и потяните его тканевыми щипцами (рисунок 5). Аккуратно перфорируйте перикард кончиком ножниц для иридэктомии, стараясь не порезать подлежащие ткани. Очистите перикард от трех камер сердца.</li>
	<li>Используйте щипцы, чтобы осторожно захватить желудочек за его вершину. Приложите ограниченное давление, чтобы между тракционными поверхностями щипцов оставалось достаточно места для прохождения перфузионной иглы (рис. 6).</li>
	<li>Введите иглу через закрытие щипцов в камеру желудочка, стараясь не перфорировать желудочек (рис. 7). Зажмите тканевые щипцы на месте с помощью иглодержателя с помощью гемостата. ПРИМЕЧАНИЕ: Эта техника стабилизирует положение иглы, которая все еще острая. Прижимание иглы непосредственно к желудочку также приведет к ненужным повреждениям, что затруднит рефиксацию в случае необходимости (см. Таблицу 1).</li>
	<li>Запустите поток насоса примерно со скоростью 5 мл/мин. Три камеры сердца и артериального ствола набухают (рис. 8; см. таблицу 1).</li>
	<li>Ножницами аккуратно проткните правую ушную раковину (слева от зрителя); Кровь прольется рекой. Установите скорость потока на уровне 5 мл/мин или увеличьте ее до 10 мл/мин.</li>
	<li>Продолжайте до тех пор, пока сосудистая сеть желудка не побледнеет (см. Таблицу 1), затем копье левой ушной раковины сердца (справа от зрителя). Если скорость потока по-прежнему составляет 5 мл/мин, увеличьте ее примерно до 10 мл/мин.</li>
	<li>Используйте трансферную пипетку для промывания целомической полости в перфузионных средах, чтобы помочь сохранить видимость и лучше оценить цвет перфузата, вытекающего из ушных раковин.</li>
	<li>Удерживайте иглу на месте до тех пор, пока перфузат, вытекающий из ушных раковин, не станет прозрачным (см. Таблицу 1) и легкое не потеряет свой красный оттенок (см. Таблицу 1; Рисунок 9).</li>
</ol>

Перфузия крови у африканских когтистых лягушек для транскриптомики и протеомики

<ol><li>Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiI+perfusion+as+a+method+for+vascular+visualization+in+Ambystoma+mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55740(2017).</li>
<li>Lametschwandtner, A., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anatomy+of+the+brain+of+the+adult+pipid+frog%2C+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+A+scanning+electron+microscopic+study+of+vascular+corrosion+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts.</a> Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).</li>
<li>Lametschwandtner, A., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anatomy+of+the+urinary+bladder+in+the+adult+African+clawed+toad%2C+Xenopus+laevis%3A+A+scanning+electron+microscope+study+of+vascular+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts.</a> Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).</li>
<li>Lametschwandtner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anatomy+of+the+gallbladder+of+the+adult+South+African+clawed+toad%2C+Xenopus+laevis+Daudin%3A+A+scanning+electron+microscope+study+of+vascular+corrosion+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts.</a> Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).</li>
<li>Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anatomy+of+the+non-lobulated+liver+of+adult+Xenopus+laevis%3A+A+scanning+electron+microscopic+study+of+vascular+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts.</a> Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).</li>
<li>Miodoński, A. J., Bär, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+supply+of+the+choriocapillaris+of+anuran+amphibians+%28Rana+temporaria%2C+Rana+esculenta%29.+Scanning+electron-microscopic+%28SEM%29+study+of+microcorrosion+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts.</a> Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).</li>
<li>Nenni, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%3A+Facilitating+the+use+of+Xenopus+to+model+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease.</a> Frontiers in Physiology. 10, 154(2019).</li>
<li>Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+toolkit+in+Xenopus%3A+Approaches+and+opportunities+for+human+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling.</a> Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).</li>
<li>Peshkin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+repertoire+in+early+vertebrate+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Briggs, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+gene+expression+in+vertebrate+embryogenesis+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution.</a> Science. 360 (6392), (2018).</li>
<li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+landscape+of+larval+and+adult+Xenopus+laevis+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution.</a> Nature Communications. 13 (1), 4306(2022).</li>
<li>AVMA (American Veterinary Medical Association). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AVMA+guidelines+for+the+euthanasia+of+animals%2C+2020+edition%5BTitle%5D)+AND+%22AVMA%22%5BJournal%5D)">AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition.</a> AVMA. , Schaumburg, Illinois. 37(2020).</li>
<li>Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bupivacaine+as+a+euthanasia+agent+for+African+Clawed+Frogs+%28Xenopus+laevis%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis).</a> PLoS One. 17 (12), e0279331(2022).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>Heinz-Taheny, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+physiology+and+diseases+of+amphibians.+Veterinary+clinics+of+North+America%5BTitle%5D)+AND+%22The+Veterinary+Clinics+of+North+America.+Exotic+Animal+Practice%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America.</a> The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).</li>
<li>Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vertebrate+heart%3A+an+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The vertebrate heart: an evolutionary perspective.</a> Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).</li>
<li>Hoops, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perfusion+protocol+for+lizards%2C+including+a+method+for+brain+removal%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal.</a> MethodsX. 2, 165-173 (2015).</li>
</ol>

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Этот протокол описывает традиционные методы диссекции для доступа к целомической полости. Другие методы также приемлемы, при условии, что они наносят минимальный ущерб тканям, сердце доступно, а легкие и желудок видны. Точно так же большинство перечисленных инструментов вскрытия можно легко заменить сопоставимыми предметами.
Несмотря на то, что были предприняты попытки оптимизировать эффективность этой процедуры, результаты могут варьироваться в зависимости от опыта и вариабельности между отде...

Перфузия всего тела амфибий обычно завершается с целью сохранения и фиксации 1,2,3,4,5,6. Однако эти процедуры происходят со скоростью, которая ограничивает количество свежих образцов, которые могут быть взяты на одно животное. Целью данной работы является разработка эффективного протокола перфузии крови в Xenopus, отдавая приоритет скорости техники. Протокол занимает менее 10 минут на животное для X. tropicalis и менее 15 минут на животное X. laevis. Второстепенными приоритетами являются простота репликации и использование легко приобретаемого оборудования, чтобы высококачественные образцы могли широко использоваться лабораториями Xenopus.
Лягушки Xenopus широко используются в биомедицинских исследованиях для изучения фундаментальных биологических и патологических процессов, сохраняющихся у разных видов. Этот четвероногий имеет более тесные эволюционные отношения с млекопитающими, чем другие водные модели, имея легкие, трехкамерное сердце и конечности с пальцами. Международное сообщество эффективно использует Xenopus для более глубокого понимания болезней человека посредством углубленного моделирования заболеваний и молекулярного анализа функции генов, связанных с болезнью. Многочисленные преимущества Xenopus в качестве животной модели делают их бесценными инструментами для изучения молекулярных основ развития и болезней человека; К таким преимуществам относятся: большой размер ооцитов и эмбрионов, высокая плодовитость, легкость размещения, быстрое внешнее развитие и простота геномных манипуляций. По оценкам, Xenopus разделяют ~ 80% идентифицированных генов болезней человека7.
По сравнению с популярными моделями млекопитающих, Xenopus является быстрой и экономически эффективной моделью, с легкостью нокдауна морфолино и наличием эффективных трансгенов и целевых мутаций генов с использованием CRISPR8. Количественная масс-спектрометрия и одноклеточная транскриптомика были успешно применены к эмбрионам Xenopus 9,10, но недавний клеточный атлас Xenopus laevis показывает, что в составе большинства тканей преобладают типы клеток крови11. Благодаря разработке метода, который обескровливает ткани с высокой скоростью и с использованием охлажденных сред, перфузия минимально влияет на свежесть образца. Это особенно важно для приложений, где цель состоит в том, чтобы профилировать физиологически невозмущенную экспрессию мРНК или белка.

<table><tbody><tr><td>5x Увеличительное стекло со светодиодной подсветкой и подставкой</td><td>amazon.com</td><td>B08QJ6J8P1</td><td>свет не должен выделять тепло</td></tr><tr><td>Одноразовые переводные пипетки</td><td>VWR</td><<td>em>414004-036</td><td></td></tr><tr><td>Препарирующие тонкозаостренные щипцы</td><td>Fisher Scinetific</td><td>08-875</td><td></td></tr><tr><td>Ножницы для препарирования острые пионты, прямые 6,5"</td><td>VWR</td><td>76457-374</td><td></td></tr><tr><td>Диссекционный лоток</td><td>Fisher Scinetific</td><td>14-370-284</td><td>листы из пенополистирола являются приемлемой альтернативой</td></tr><tr><td>контейнеру для эвтаназии</td><td>US Plastic</td><td>Item&nbsp; 2860</td><td>альтернативных непрозрачных контейнеров приемлемая</td></tr><tr><td>крышка контейнера для эвтаназии</td><td>US Plastic</td><td>Item&nbsp; 3047</td><td></td></tr><tr><td>Тонкие рассекающие штифты</td><td>Живые системы Контрольно-измерительные приборы</td><td>PIN-#3</td><td></td></tr><tr><td>Иглы для подкожных инъекций общего назначения, 22 г</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5A</td><td>для X. laevisИглы</td></tr> <tr><td>для подкожных инъекций, 25 г</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826AA</td><td>для X. tropicalis</td></tr><tr><td>Гепарин, слизистая</td> <td>оболочка кишечника свиньиMilliporeSigma</td><td>37-505-410MG</td><td></td></tr><tr><td>Иридэктомические ножницы 6"</td><td>vwr</td><td>470018-938</td><td>Ножницы для радужной оболочки являются приемлемой альтернативой</td></tr><tr><td>адаптеру Luer-to-barb male Luer со стопорным кольцом</td><td>amazon.com</td><td>B09PTX6M2Z</td><td>размер будет зависеть от шланга используемого</td></tr><tr><td>иглодержателя Mayo-Hegar</td><td>Fisher Scinetific</td><td>08-966</td><td>москитные щипцы являются приемлемой альтернативой</td></tr><tr><td>MS-222: Синкаин (ранее трикаин)</td><td>Pentair AES</td><td>TRS1</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Перистальтический жидкостный насос-дозатор 5&ndash; 100 мл/мин</td><td>amazon.com</td><td>B07PWY4SM6</td><td>любым перистальтическим насосом, способным откачивать 5-10 мл/мин допустимо</td></tr><tr><td>Точильный камень</td><td>VWR</td><td>470150-112</td><td>опционально; для притупления иглы</td></tr><tr><td>Бикарбонат натрия, порошок, USP</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-606-333</td><td></td></tr><tr><td>Образец щипцов, зубчатый</td><td>VWR</td><td>82027-442</td><td></td></tr><tr><td>Т-образные штифты для препарирования</td><td>Фишера Scinetific</td><td>S99385</td><td></td></tr><tr><td>Ультратонкие короткие инсулиновые шприцы, 31 г</td><td>VWR</td><td>BD328438</td><td></td></tr><tr><td>Проволочные промывочные ножницы, 6-дюймовые ультраострые и мощные боковые ножницы</td><td>amazon.com</td><td>B087P191LP</td><td></td></tr></tbody></table>

Эффективная быстрая перфузия крови у xenopus

Effective Rapid Blood Perfusion in Xenopus

Xenopus были мощными модельными организмами для понимания развития позвоночных и болезней на протяжении более 100 лет. Здесь определяется протокол быстрой перфузии крови в Xenopus, направленный на последовательное и резкое сокращение крови во всех тканях. Перфузия осуществляется путем введения иглы непосредственно в желудочек сердца и перекачивания гепаринизированного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) через сосудистую систему. Процедура может быть завершена примерно за 10 минут на животное. В крови преобладают несколько очень распространенных белков и типов клеток, что создает многочисленные проблемы, поскольку эти белки маскируют большинство других молекул и типов клеток, представляющих интерес. Воспроизводимая характеристика тканей взрослого Xenopus с помощью количественной протеомики и одноклеточной транскриптомики выиграет от применения этого протокола до отбора проб органов. Протоколы отбора проб тканей определены в сопроводительных документах. Эти процедуры направлены на стандартизацию практики Xenopus разного пола, возраста и состояния здоровья, в частности X. laevis и X. tropicalis.

После успешной перфузии все ткани (за исключением печени у пигментированного ксенопуса) будут заметно светлее и менее насыщены кровью. Крупные кровеносные сосуды станут менее заметными (рис. 10), а ткани (за исключением печени) будут чисто промыты в буфере после отбора проб. Хотя успешное выполнение протокола в конечном итоге может быть подтверждено только качеством данных из обескровленных образцов тканей, несколько типичных проблем, их возможные причины и предлагаемые корректирующ...

Здесь представлен эффективный протокол быстрой перфузии крови для подготовки образцов тканей африканских когтистых лягушек для исследований транскриптомики и протеомики.

Эффективная быстрая перфузия крови у Xenopus

Xenopus have been powerful model organisms for understanding vertebrate development and disease for over 100 years. Here, a rapid blood perfusion protocol ...

Эта процедура сосредоточена на гуманном использовании моделей амфибий таким образом, чтобы максимизировать эффективность. Методы стандартизации могут быть применены к образцам, взятым и сохраненным в исходной колонии, что снижает риски биобезопасности и устраняет стресс при транспортировке животных. Изобилие может быть завершено быстро, максимально увеличивая время, доступное для отбора образцов тканей, пока они еще свежие.Эта свежесть особенно важна для протеомного и транскриптомного профилирования. Этот протокол является подробным и явным, что делает его пригодным для использования людьми с самым разным опытом. Это облегчает обмен высококачественными образцами между лабораториями Xenopus.Наряду с этим методом изобилия разрабатывается аналогичный всеобъемлющий протокол для стандартизированного отбора проб всех основных органов.

effective-rapid-blood-perfusion-in-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Этот протокол демонстрирует основанный на флуоресценции метод для визуализации сосудистой сети и для количественной оценки ее сложности у Xenopus tropicalis . Кровеносные сосуды можно визуализировать через несколько минут после введения флуоресцентного красителя в сердцебиение эмбриона после генетических и / или фармакологических манипуляций для исследования сердечно-сосудистого развития in vivo .

Визуализация и количественный анализ эмбрионального ангиогенеза у<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Используя липофильную методику окрашивания перхлоратом 1,1'-диоктадеци-3,3,3 ', 3'-тетраметилиндокарбоцианин (DiI), Ambystoma mexicanum может подвергаться сосудистой перфузии, что позволяет легко визуализировать сосудистую систему.

Перфузия DiI как метод сосудистой визуализации в<em&gt; Разное</em

Здесь мы представляем пробирного сосудистой проницаемости мозга мыши, используя внутрибрюшинного введения флуоресцентных Трейсеры следуют перфузии, которая применима к Животные модели blood - brain барьер дисфункции. Один hemi мозг используется для количественной оценки проницаемость и другой для трассировочного визуализации/иммуноокрашивания. Процедура занимает 5-6 ч для 10 мышей.

В естественных условиях Blood - brain барьер проницаемость Assay мышей с использованием дневно помечены Трейсеры

Нормотермических ex situ сердце перфузии (ESHP), сохраняет сердце избиение, полу физиологического состояния. При выполнении в рабочем режиме, ESHP предоставляет возможность выполнения сложных оценок доноров сердца функции и орган жизнеспособности. Здесь мы описываем наш метод для оценки миокарда производительности во время ESHP.

Нормотермических Ex Situ сердце перфузии в рабочем режиме: оценки функции сердца и метаболизма

Здесь представлен протокол экс естественных материнских сосудистой перфузии сосудов, позволяющий администрацию тестовой статьи в материнские сосуды и оценить плацентарный перенос ксенобибиотических частиц или фармакологического вещества в дополнение к изменениям в Физиология плаценты.

Ex естественных условиях перфузии плаценты грызунов

Протокол описан для in situ перфузии нижней части тела мыши, в том числе мочевого пузыря, простаты, половых органов, кости, мышцы и стопы кожи.

Создание In Situ закрытого цепи перфузии нижних органов брюшной полости и задних конечностей у мышей

В этой статье представлено руководство по выборке шести важных и разнообразных органов у взрослого Xenopus , к которым можно быстро и легко получить доступ: желудочек сердца, доля печени, поджелудочная железа, жировые тела, парные почки и кожа.

Методы быстрого отбора проб шести важнейших органов у взрослого Xenopus

Этот протокол представляет собой быстрый метод количественной трехмерной визуализации сосудов с использованием флуоресцентной микроскопии световых листов. Эффективность метода продемонстрирована на примере системы артерий глоточной дуги модели куриного эмбриона, при этом гемодинамические силы количественно оцениваются с помощью вычислительной гидродинамики.

Быстрая визуализация сосудистой сети мелких животных с высоким разрешением для количественных исследований

Это первая часть комплексного протокола отбора проб Xenopus . Образцы тканей включают желудочек сердца, артериальный ствол, левую долю печени, желчный пузырь, легкие, поджелудочную железу, селезенку, гортань, пищевод, желудок, кишечник, яички, жировые тела, яйцевод, парные почки, седалищное сплетение, кожу, тимус и весь глаз.

Эффективные методы комплексного отбора проб доступных тканей у взрослых Xenopus

В этой статье мы представляем протокол для модифицируемой нормотермической перфузионной системы ex vivo с открытым исходным кодом, предназначенной для преодоления высокой стоимости и ограниченной гибкости существующих платформ, обеспечивая более доступное, экономичное и итеративное использование в доклинических биомедицинских исследованиях.

Нормотермическая перфузионная система с открытым исходным кодом, разработанная для ученых-исследователей

Узнайте метод быстрой перфузии крови у Xenopus laevis и Xenopus tropicalis для транскриптомики и протеомики. Этот протокол обеспечивает гуманное обращение и высокое качество образцов тканей.

Эффективная быстрая перфузия крови у Xenopus

Больше видео