Функциональная сайт-направленная флуорометрия в нативных клетках для изучения возбудимости скелетных мышц
2 июня 2023 г.
Функциональная сайт-направленная флуорометрия — это метод изучения движений белковых доменов в режиме реального времени. Модификация этого метода для его применения в нативных клетках теперь позволяет обнаруживать и отслеживать движения одного датчика напряжения из потенциал-зависимых каналов Ca2+ в изолированных волокнах скелетных мышц мышей.
CaV1.1, член потенциал-зависимых ионных каналов, имеет четыре различных датчика напряжения. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что некоторые датчики напряжения вносят больший вклад в активацию рецептора рианодина или кальциевого тока. Мы стремимся иметь возможность точно определить роль каждого датчика напряжения в связи возбуждения-сжатия и активации кальциевых каналов.
Связь возбуждения-сокращения изучается с начала 50-х годов, но молекулярные детали того, как происходит этот процесс, до сих пор неизвестны. Недавний прогресс в цироэлектронной микроскопической структуре канала, характеристика нового вспомогательного белка CaV1.1, открытие альтернативного варианта сплайсинга каналов и идентификация болезнетворных мутаций возродили интерес к этой области. В нашей области используются многие методы, от классической электрофизиологии и молекулярной биологии до более новых методов, таких как криоэлектронная микроскопия, молекулярно-динамическое моделирование, целенаправленная деградация белка и функциональная сайт-направленная флуорометрия, а также инженерные клетки или модели животных.
В настоящее время топливо сталкивается с несколькими экспериментальными проблемами. В скелетных мышцах надлежащий трафик и связь между CaV1.1 и RyR1, наряду со многими регуляторными белками, имеют решающее значение для поддержки связи возбуждения-сокращения. Методы непосредственного изучения этих белково-белковых взаимодействий между CaV1.1 и RyR1 отсутствуют или неполны.
Лаборатория доктора Мартина Шнайдера десятилетиями работала над связью возбуждения-сокращения, характеризуя механизмы чувствительности напряжения в CaV1.1, высвобождение кальция и локализованные события высвобождения кальция, известные как искры кальция. В последнее время наша лаборатория внедряет новые оптические методы для исследования различных этапов связи возбуждения-сокращения и движения датчика напряжения в функционирующих мышечных клетках взрослого человека. Хотя это было сделано ранее в системе гетерологичной экспрессии, наш протокол теперь позволяет отслеживать конформационные изменения в датчиках напряжения CaV1.1 во время распространения потенциала действия в его родной среде.
Наша новая методика позволит нам исследовать точное движение датчика напряжения, необходимого для связи возбуждения-сжатия. Мы хотим знать, какие остатки заряда в каждом S4 имеют решающее значение для его функции, или именно каждый S4 транслоцируется, и вся эта транслокация связана с открытием CaV1.1 или активацией рецептора рианодина.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучается движение сенсоров напряжения в потенциал-зависимых кальциевых каналах Kv1.1, которые играют важную роль в электромеханическом сопряжении в скелетных мышцах мыши. Используя функциональную сайт-направленную флуорометрию, исследователи обеспечили возможность отслеживания перемещений этих белковых доменов в режиме реального времени в их естественном клеточном контексте.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Электромеханическое сопряжение
- Потенциал-зависимые ионные каналы
- Движения белковых доменов
Теоретическая база
- Kv1.1 имеет четыре отдельных датчика напряжения, связанных с кальциевой сигнализацией.
- Понимание их точной роли может пролить свет на механизмы мышечного сокращения.
- Предыдущие методы не позволяли изучать эту динамику в естественной среде.
Используемые методы
- Функциональная сайт-направленная флуориметрия
- Волокна скелетных мышц мыши
- Маркировка флуоресцентными белками и регистрация ионных токов
Основные результаты
- Отслеживание перемещений вольтажных сенсоров в режиме реального времени во время потенциалов действия.
- Изменения конфигурации вольтажных сенсоров Kv1.1, коррелирующие с электромеханическим сопряжением.
- Подтверждение влияния специфических заряженных остатков на функциональность вольтажного сенсора.
Выводы
- Данное исследование позволяет глубже понять динамическое поведение датчиков напряжения, имеющих решающее значение для функционирования мышц.
- Эта методология расширяет понимание как нормальной физиологии, так и патологических состояний, связанных с возбуждением мышц.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Функциональная сайт-направленная флуориметрия в нативных клетках скелетных мышц позволяет в режиме реального времени анализировать конформационные изменения вольтаж-зависимых ионных каналов, что дает прямую информацию для валидации мишеней на ранних этапах и снижения механистических рисков в исследованиях возбудимости мышц. Данный подход устраняет разрыв между гетерологичными системами и физиологически релевантными моделями, повышая прогностическую достоверность портфелей препаратов, нацеленных на ионные каналы. Его интеграция способствует принятию более обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) в рамках поисковых и доклинических программ, ориентированных на нейромышечные заболевания и каналопатии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает возможность прямого анализа функции датчика напряжения в нативных мышечных волокнах для надежной валидации мишени.
- Разъясняет механистический вклад конкретных доменов канала в электромеханическое сопряжение.
- Повышает прогностическую достоверность путем установления связи между структурными перестройками и функциональными результатами в системах, релевантных для данной патологии.
- Способствует снижению биологических рисков за счет подтверждения взаимодействия с мишенью в физиологически релевантных условиях.
Скрининг и разработка метода анализа
- Позволяет подготовить валидированные системы мышечных волокон для последующего скрининга модуляторов, влияющих на конформацию или функцию каналов.
- Обеспечивает количественные и воспроизводимые показатели флуоресценции и электрофизиологического отклика для стандартизации анализа.
- Поддерживает масштабируемость и повторное использование платформы путем адаптации протокола для других ионных каналов и белков.
- Повышает надежность оценки соединений за счет интеграции структурных и функциональных измерений в режиме реального времени.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям, релевантным заболеванию, за счет использования мышечных волокон взрослых мышей для обеспечения трансляционной преемственности.
- Позволяет принимать обоснованные решения о продвижении разработки с учетом рисков, предоставляя понимание механизмов дефектов сопряжения возбуждения и сокращения.
- Способствует согласованию биомаркеров посредством количественного измерения динамики сенсоров напряжения, связанных с функциональными результатами.
- Снижает риски доклинических программ, направленных на лечение ионных каналопатий, путем валидации механистических гипотез в нативной ткани.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в общий процесс поиска лекарственных средств — от ранней валидации мишени до идентификации соединений-лидеров и доклинических исследований механизмов действия, в частности, в рамках программ по изучению ионных каналов и возбудимости мышц.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей передачи сигнала путем прямого измерения перемещений сенсоров напряжения во время потенциалов действия.
- Скрининг: предоставляет готовые к анализу воспроизводимые системы с количественными показателями флуоресценции и тока.
- Аналитика: обеспечивает количественные измерения конформационных изменений с временным разрешением для сравнительного анализа в различных условиях.
- Трансляционные исследования: поддерживает преемственность за счет использования нативных мышечных волокон, что способствует согласованию биомаркеров и моделей заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: предлагает многократно используемую платформу, адаптируемую к другим ионным каналам и мембранным белкам в мышцах и возбудимых тканях.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней ионных каналов.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость функциональных анализов в нативных системах.
- Стратегическая ценность: повышает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет раннего снижения механистических рисков.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение программ, направленных на ионные каналы и мышечную ткань.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области электрофизиологии, флуоресцентной визуализации и молекулярной биологии для разработки конструкций и интерпретации данных.
- Необходимо специализированное оборудование для одновременной регистрации флуоресценции и тока в мышечных волокнах.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости результатов для различных мишеней и конструкций ионных каналов.
- Адаптация метода к другим модельным системам может потребовать оптимизации протоколов трансфекции и маркировки.
- Потенциальные ограничения включают фоновое окрашивание и артефакты движения, что требует тщательного контроля экспериментов.
