Количественная детекция ДНК-белковых сшивок и их посттрансляционных модификаций
21 апреля 2023 г.
В настоящем протоколе представлен модифицированный метод обнаружения и количественного определения ДНК-белковых сшивок (ДПК) и их посттрансляционных модификаций (ПТМ), включая убиквитилирование, SUMOylation и АДФ-рибозилирование, индуцированные ингибиторами топоизомеразы и формальдегидом, что позволяет изучать образование и репарацию ДПК и их ПТМ.
Мои исследования сосредоточены на восстановлении повреждений ДНК. В частности, репарация повреждений ДНК, индуцированных ингибиторами топоизомеразы, ингибиторами PARP и альдегидами. Я пытаюсь проиллюстрировать молекулярные механизмы, с помощью которых клетки восстанавливают поперечные связи белков ДНК, индуцированные этими препаратами.
Недавние достижения в репарации поперечных связей белков ДНК включают идентификацию новых путей репарации для поперечных связей белков ДНК и механизмов посттрансплантационной модификации, которые регулируют эти пути репарации. Анализ комплекса ферментов in vivo и анализ быстрого подхода к восстановлению аддукта ДНК являются наиболее используемыми методами для измерения поперечных связей белков ДНК, и некоторые сшивки белков ДНК, такие как поперечные сшивки белка ДНК топоизомеразы одного, могут быть обнаружены с помощью иммунофлуоресценции с использованием специфического антитела. Одной из самых больших проблем является изучение роли посттрансляционных модификаций в репарации поперечных связей белков ДНК.
Было очень сложно обогатить и обнаружить посттрансляционные сшивания, конъюгированные белки ДНК модификаторов из-за их очень низкой распространенности. Этот протокол предоставляет подробную информацию об обнаружении количественного определения деубибиквитилированных, SUMOylated и ADP-рибозилированных поперечных связей белков ДНК, что позволяет исследователям изучать кинетику и формирование этих модификаций при репарации поперечных связей белков ДНК из различных источников. Другие протоколы детектирования сшитых белков ДНК не содержат шагов, описывающих детекцию их посттрансляционных модификаций.
В то время как этот протокол содержит такие детали, как концентрации лекарств и продолжительность времени для индуцирования модификаций и методы разделения и обнаружения модификаций, а также методы стабилизации модификаций. Таким образом, было выявлено несколько посттрансплантационных модификаций в репарации поперечных связей белков ДНК. Как они координируют ремонт, остается в значительной степени неизвестным.
Таким образом, взаимодействие между этими модификациями требует дальнейшего изучения.
Обзор
В данном протоколе описывается модифицированный метод детектирования и количественного определения сшивок ДНК-белок (DPC) и их посттрансляционных модификаций (PTM). Основное внимание уделяется влиянию ингибиторов топоизомеразы и формальдегида на формирование и репарацию DPC.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Репарация повреждений ДНК
- Посттрансляционные модификации
- Клеточный ответ на ингибиторы топоизомеразы
Введение
- Перекрестные сшивки ДНК с белками (DPC) создают серьезные трудности для клеточных механизмов репарации.
- Последние достижения позволили выявить новые пути и механизмы, регулирующие репарацию DPC.
- Посттрансляционные модификации играют ключевую роль в репарации DPC.
- Существующие протоколы часто игнорируют детектирование этих модификаций.
Цель исследования
- Представить детальный протокол обнаружения и количественного определения DPC и их ПТМ.
- Выяснить кинетику и механизмы образования таких модификаций, как убиквитин-лирование и SUMO-илирование.
- Углубить понимание взаимодействия различных посттрансляционных модификаций при репарации DPC.
Используемые методы
- Культивирование клеток и воздействие индукторами DPC.
- Выделение и нормализация ДНК, содержащей сшитые белки.
- Вестерн-блоттинг для обнаружения специфических модификаций и DPC.
- Количественное определение концентрации ДНК и анализ модификаций.
Основные результаты
- Пик образования комплексов TOP1-ДНК (DPC) наступил через 20 минут воздействия камптотецина.
- В ответ на воздействие индукторов DPC наблюдались модификация SUMO1 и убиквитинирование.
- Уровни модификации снижались дозозависимым образом при применении камптотецина.
- Были получены новые данные о динамике механизмов репарации DPC.
Выводы
- Данный протокол позволяет детально изучить ДПК и их посттрансляционные модификации.
- Понимание этих процессов имеет решающее значение для выяснения путей репарации ДНК.
- Требуются дальнейшие исследования для изучения координации различных модификаций.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Количественное определение сшивок ДНК-белок (DPC) и их посттрансляционных модификаций (PTM) позволяет устранить критический пробел в понимании механизмов репарации повреждений ДНК, имеющих значение для разработки лекарственных препаратов. Эта возможность обеспечивает mechanistic de-risking и прогностическую уверенность в отношении соединений, воздействующих на пути репарации ДНК, особенно в условиях воздействия химиотерапевтических средств и сшивающих агентов. Надежное обнаружение и количественное определение DPC, конъюгированных с PTM, способствует валидации мишеней на ранних этапах и позволяет принимать обоснованные решения по управлению портфелем с учетом рисков.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет проверять терапевтические гипотезы, касающиеся репарации ДНК и координации посттрансляционных модификаций (PTM).
- Способствует снижению биологических рисков путем выяснения взаимодействия убиквитинилирования, SUMOилирования и ADP-рибозилирования при репарации ДНК-белковых комплексов (DPC).
- Облегчает функциональную валидацию мишеней для ферментов и путей, регулирующих разрешение DPC.
- Предоставляет количественные данные для повышения прогностической достоверности и приоритизации мишеней репарации ДНК.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга низкомолекулярных модуляторов репарации DPC.
- Обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет количественного иммунодетекции ПТМ.
- Обеспечение готовности к скринингу соединений, влияющих на формирование, модификацию или кинетику репарации DPC.
- Получение надежных количественных данных для оценки соединений в путях ответа на повреждение ДНК.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям релевантных заболеваний, в которых накопление или восстановление DPC влияет на терапевтический ответ.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации, позволяя проводить механистические исследования модуляции путей репарации.
- Поддерживает принятие решений о продвижении терапевтических средств, нацеленных на репарацию ДНК, с учетом рисков.
- Обладает прогностической ценностью для снижения рисков путем количественной оценки динамических изменений PTM в ответ на исследуемые препараты.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Этот иммуноанализ интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, позволяя проводить количественный анализ механизмов репарации DPC и динамики PTM после воздействия лекарственных препаратов или агентов.
- Открывательная биология: позволяет проверять гипотезы о роли посттрансляционных модификаций (ПТМ) в репарации белков с ковалентными сшивками с ДНК (DPC) и уточнять соответствующие сигнальные пути.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты иммуноблоттинга для разработки анализов и скрининга соединений.
- Аналитика: дает количественные показатели содержания DPC и ПТМ для сравнительного анализа в различных условиях.
- Трансляционные исследования: позволяет сопоставлять данные с моделями заболеваний, в которых репарация DPC является терапевтической мишенью.
- Повторное использование в масштабах предприятия: служит универсальной платформой для изучения различных агентов, индуцирующих образование DPC, и модуляторов репарации.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней репарации ДНК.
- Операционная ценность: Стандартизирует детекцию низкокопийных динамических PTM на DPC для получения воспроизводимых результатов.
- Стратегическая ценность: Обосновывает решения о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) и распределение капиталов путем уточнения степени задействованности путей репарации.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритезацию мишеней репарации ДНК и терапевтических кандидатов с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области биологии повреждений ДНК и методов иммунодетекции.
- Необходим доступ к оборудованию для культивирования клеток, выделения ДНК и иммуноблоттинга.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости количественных результатов.
- Может потребоваться адаптация метода для различных типов клеток или агентов, индуцирующих образование DPC.
- Чувствительность детекции ограничена низкой концентрацией и динамической природой DPC, конъюгированных с PTM.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
3:09
Cell Culture and Drug Treatment in the Human Embryonic Kidney 293 (HEK293) Cell Line
4:19
Isolation and Normalization of DNA Containing Crosslinked Proteins
7:02
Western Blotting of Digested DNA Samples Containing DNA‐Protein Crosslinks ( DPCs)
