Количественная детекция ДНК-белковых сшивок и их посттрансляционных модификаций

В настоящем протоколе представлен модифицированный метод обнаружения и количественного определения ДНК-белковых сшивок (ДПК) и их посттрансляционных модификаций (ПТМ), включая убиквитилирование, SUMOylation и АДФ-рибозилирование, индуцированные ингибиторами топоизомеразы и формальдегидом, что позволяет изучать образование и репарацию ДПК и их ПТМ.

Мои исследования сосредоточены на восстановлении повреждений ДНК. В частности, репарация повреждений ДНК, индуцированных ингибиторами топоизомеразы, ингибиторами PARP и альдегидами. Я пытаюсь проиллюстрировать молекулярные механизмы, с помощью которых клетки восстанавливают поперечные связи белков ДНК, индуцированные этими препаратами.

Недавние достижения в репарации поперечных связей белков ДНК включают идентификацию новых путей репарации для поперечных связей белков ДНК и механизмов посттрансплантационной модификации, которые регулируют эти пути репарации. Анализ комплекса ферментов in vivo и анализ быстрого подхода к восстановлению аддукта ДНК являются наиболее используемыми методами для измерения поперечных связей белков ДНК, и некоторые сшивки белков ДНК, такие как поперечные сшивки белка ДНК топоизомеразы одного, могут быть обнаружены с помощью иммунофлуоресценции с использованием специфического антитела. Одной из самых больших проблем является изучение роли посттрансляционных модификаций в репарации поперечных связей белков ДНК.

Было очень сложно обогатить и обнаружить посттрансляционные сшивания, конъюгированные белки ДНК модификаторов из-за их очень низкой распространенности. Этот протокол предоставляет подробную информацию об обнаружении количественного определения деубибиквитилированных, SUMOylated и ADP-рибозилированных поперечных связей белков ДНК, что позволяет исследователям изучать кинетику и формирование этих модификаций при репарации поперечных связей белков ДНК из различных источников. Другие протоколы детектирования сшитых белков ДНК не содержат шагов, описывающих детекцию их посттрансляционных модификаций.

В то время как этот протокол содержит такие детали, как концентрации лекарств и продолжительность времени для индуцирования модификаций и методы разделения и обнаружения модификаций, а также методы стабилизации модификаций. Таким образом, было выявлено несколько посттрансплантационных модификаций в репарации поперечных связей белков ДНК. Как они координируют ремонт, остается в значительной степени неизвестным.

Таким образом, взаимодействие между этими модификациями требует дальнейшего изучения.