ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Келли Брин Черч, г-на Майкла Крайсмана и г-жу Джессику Янг за их вклад в сбор данных, представленных в репрезентативных результатах. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) R00 HD104994 (R.B.M.).

Все процедуры были одобрены Университетом штата Колорадо (#3960) и Комитетами по институциональному уходу за животными и использованию животных Калифорнийского университета в Сан-Диего, где были собраны репрезентативные данные (S13235, PI Kellie Breen Church). Данные пяти взрослых самок и двух взрослых самцов мышей C57/BL6 (в возрасте 9-16 недель) представлены в разделе репрезентативных данных. Самкам мышей проводили овариоэктомию за 3-4 недели до инъекции ICV и забора крови, как описано ранее7. До эксперимента эти мыши содержались с циклом 12 часов света и 12 часов темного света и имели свободный доступ к корму и воде в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию.
1. Выполнение трепанации черепа
ПРИМЕЧАНИЕ: Трепанация черепа может быть выполнена за один или несколько дней до фактической инъекции, что ускоряет процесс инъекции в день эксперимента.
<ol><li>Подготовьте материалы для трепанации черепа, как описано ниже.<ol><li>Положите на рабочую поверхность чистую накладку или драпировочный материал. Прикрепите носовой обтекатель испарителя изофлурана к рабочей поверхности (близко к экспериментатору, но в противоположную сторону; см. рисунок 1А).</li>
		<li>Наденьте силастическую трубку на конец стерильной острой иглы 18 G так, чтобы ~1 мм кончика иглы выступало. Поместите силастическую трубку на конец стерильной тупой иглы так, чтобы ~1 мм кончика иглы выступало. ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой мыши следует использовать отдельные стерильные предварительно упакованные иглы (острые и тупые).</li>
		<li>Подготовьте электробритву, йодный скраб, стерильную марлю и спиртовые салфетки для подготовки места инъекции.</li>
	</ol></li>
	<li>Потренируйтесь перемещать иглу на 2 мм вбок и на 1 мм в хвост, как описано ниже.<ol><li>С помощью линейки и ручки отметьте на листе бумаги начальную точку (это будет брегма), отметку в 2 мм слева или справа и еще одну отметку на 1 мм выше последней (это будет место инъекции; см. рисунок 1Б).</li>
		<li>Потренируйтесь перемещать иглу от начальной точки к отметке 1 к отметке 2 (брегма к месту инъекции) до тех пор, пока не убедитесь, что движение повторяется без направляющих. ПРИМЕЧАНИЕ: Координаты, описанные здесь, эффективны для взрослых мышей C57/BL6, но другие штаммы или возрастные группы могут потребовать корректировки.</li>
	</ol></li>
	<li>Подготовьте мышь к трепанации черепа, как описано ниже.<ol><li>Поместите мышь в индукционную камеру и обезболите мышь 3%-4% изофлураном в медицинском кислороде. С практикой и знакомством с процедурой сократите общую продолжительность воздействия изофлурана до менее чем 10 минут для процедуры трепанации черепа. ВНИМАНИЕ: Воздействие изофлурана опасно для здоровья человека; Используйте одобренный и проверенный испаритель изофлурана в хорошо проветриваемом помещении со средствами очистки отходящих газов.</li>
		<li>Как только рефлекс на пальцах ног отсутствует, побрейте голову животного. Нанесите смазку для глаз.</li>
		<li>Поместите мышь на рабочую поверхность головой в носовой конус для поддержания анестезии.</li>
		<li>Вводите обезболивающее средство, такое как бупренорфин (0,6-0,8 мг/кг массы тела мыши, подкожно), в соответствии с указаниями врача.</li>
		<li>Очистите место укола, протерев голову стерильной марлей, смоченной в растворе йода (выполните три скраба), а затем протрите спиртовой салфеткой (выполните трижды). ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите шерсть и очистите кожу вокруг места инъекции и используйте стерильные инструменты и иглы, как рекомендовано Американской ветеринарной медицинской ассоциацией для предотвращения инфекций.</li>
	</ol></li>
	<li>Крепко возьмитесь за голову мыши недоминантной рукой. Расположите головку как можно ровнее на рабочей поверхности.</li>
	<li>Найдите место инъекции.<ol><li>С помощью подготовленной острой иглы 18 G сначала определите брегму; Для этого проведите иглой по коже головы по средней линии, двигаясь в рострально-каудальной плоскости. Представьте себе равносторонний треугольник, в котором две вершины являются глазами, а третья вершина — приблизительным расположением брегмы (см. рис. 1C).</li>
		<li>От брегмы переместите иглу на 2 мм латерально и на 1 мм каудально к месту инъекции.</li>
	</ol></li>
	<li>Держа иглу вертикально, с силой протолкните иглу через кожу и кость, пока трубка не окажется на одном уровне с кожей.</li>
	<li>Втяните иглу, поверните иглу и снова надавите на кожу и кость. Повторяйте процесс до тех пор, пока в кости не образуется небольшое отверстие.</li>
	<li>Используйте тупую иглу, чтобы убедиться, что в кости образовалось достаточное отверстие. Постарайтесь сделать отверстие в кости, достаточно большое, чтобы тупая игла могла пройти через него.</li>
	<li>Извлеките мышь из носового конуса, удалите кровь с места инъекции стерильной марлей и поместите мышь в клетку на обогреватель до пробуждения. Поскольку отверстие, сделанное при трепанации черепа, небольшое (игла 18 G), место не нужно закрывать швом или зажимами для раны. ПРИМЕЧАНИЕ: Отверстие здесь небольшое (18 G), поэтому многие учреждения считают эту процедуру инъекцией, а не хирургическим вмешательством. Более того, несмотря на то, что через кожу и кости делается отверстие в мозг, натягивание кожи приводит к тому, что отверстия не совпадают, что, вероятно, помогает предотвратить контакт кожной флоры или подстилки клетки с мозгом.</li>
</ol>2. Впрыск
<ol><li>Подготовьте материалы для инъекции, как описано ниже.<ol><li>Положите на рабочую поверхность чистую накладку или драпировочный материал. Прикрепите носовой обтекатель испарителя изофлурана к рабочей поверхности (близко к экспериментатору, но в противоположную сторону; см. рисунок 1А).</li>
		<li>Прикрепите иглу длиной 10 мм 27 G со скосом 45° к стеклянному шприцу объемом 5 мкл. Наденьте на иглу силастическую трубку так, чтобы выступало 3,5 мм кончика иглы; используйте лабораторную ленту, чтобы прикрепить трубку к корпусу шприца (см. рисунок 1D).</li>
		<li>Подготовьте среду для инъекций (лекарство, вирус или другую жидкость для инъекций) в пробирке. Для получения репрезентативных результатов в этом исследовании вводили стерильный изотонический физиологический раствор. ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите пробирку, к которой можно получить доступ с помощью стеклянного шприца и иглы, например, пробирку для микроцентрифуги объемом 2 мл.</li>
		<li>Наберите 3 мкл среды для инъекций в стеклянный шприц. Сначала наберите больше, чем нужно, и выталкивайте до тех пор, пока в шприце не останется 3 мкл.</li>
		<li>Соберите йодный скраб, стерильную марлю и спиртовые салфетки для подготовки места инъекции.</li>
		<li>Запустите лабораторный таймер в режиме обратного отсчета и разместите таймер так, чтобы он был виден экспериментатору во время выполнения инъекций.</li>
		<li>Потренируйтесь перемещать иглу на 2 мм в сторону и на 1 мм в хвост, как это делалось накануне.</li>
	</ol></li>
	<li>Подготовьте мышь к инъекции, как описано ниже.<ol><li>Поместите мышь в индукционную камеру и обезболивайте мышь изофлураном. Как только рефлекс пальцев ног исчезнет, нанесите смазку для глаз и поместите мышь на рабочую поверхность головой в носовом конусе.</li>
		<li>Очистите место укола тремя салфетками от йода и спирта. Определите место инъекции иглой 18 G (или затупленной иглой), как описано в шаге 1.8. Отверстие, созданное во время трепанации черепа, должно быть обнаруживаемым. ПРИМЕЧАНИЕ: Если трепанация черепа не была выполнена заранее, или если отверстие в черепе не обнаруживается, трепанация черепа может быть выполнена здесь.</li>
	</ol></li>
	<li>Выполните инъекцию стеклянным шприцем, как описано ниже.<ol><li>Крепко возьмитесь за голову мыши недоминантной рукой. Расположите головку как можно ровнее на рабочей поверхности.</li>
		<li>Поместите иглу стеклянного шприца в отверстие в черепе до тех пор, пока трубка, помещенная над иглой, подготовленной на шаге 2.1.2, не упрется в кожу мыши.</li>
		<li>Держите шприц как можно вертикальнее, обращая внимание как на корональную, так и на сагиттальную плоскости. Медленно вводите среду в течение 1 минуты.</li>
		<li>Подержите шприц и иглу на месте еще минуту после завершения инъекции, чтобы свести к минимуму обратный поток. Медленно отведите иглу от головки мыши.</li>
		<li>Извлеките мышь из носового конуса, удалите кровь из места инъекции стерильной марлей (если она присутствует) и поместите мышь в клетку на обогреватель клетки до тех пор, пока она не проснется.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Подтверждение места инъекции
<ol><li>Глубоко обезболивайте и перфузируйте мышь физиологическим раствором и 4% параформальдегидом в фосфатно-солевом буфере (PBS), как описано ранее8. Храните мозг в 30% сахарозе в PBS при температуре 4 °C до тех пор, пока мозг не опустится (обычно 2 дня).</li>
	<li>Вырежьте корональные срезы 20-50 мкм на криостате, как описано ранее9. Во время секционирования наблюдайте за инъекционным трактом в тканевом блоке. Запишите, четко ли инжекционный тракт пересекает боковой желудочек.</li>
</ol>

Выполнение интрацеребровентрикулярной инъекции мышам методом свободной руки

<ol><li>Roseweir, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+potent+kisspeptin+antagonists+delineate+physiological+mechanisms+of+gonadotropin+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation.</a> Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).</li>
<li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51863(2014).</li>
<li>Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+intracerebroventricular+injection+of+CD4%28%2B%29+T+cells+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100725(2021).</li>
<li>Russo, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+control+of+the+female+reproductive+axis+through+gated+responsiveness+of+the+RFRP-3+system+to+VIP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling.</a> Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).</li>
<li>Laursen, S. E., Belknap, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+injections+in+mice.+Some+methodological+refinements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+Methods%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements.</a> Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).</li>
<li>Haley, T. J., McCormick, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+effects+produced+by+intracerebral+injection+of+drugs+in+the+conscious+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse.</a> British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).</li>
<li>McCosh, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-induced+hypoglycaemia+suppresses+pulsatile+luteinising+hormone+secretion+and+arcuate+Kiss1+cell+activation+in+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice.</a> Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813(2019).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>Comba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+glioma+subregions+for+spatial+and+molecular+characterization+of+intratumoral+heterogeneity%2C+oncostreams%2C+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion.</a> Journal of Visual Experiments. (158), e60939(2020).</li>
<li>Porteous, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reformulation+of+PULSAR+for+analysis+of+pulsatile+LH+secretion+and+a+revised+model+of+estrogen-negative+feedback+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice.</a> Endocrinology. 162 (11), (2021).</li>
<li>Hohmann, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+melanocortins+in+mediating+leptin%27s+central+effects+on+feeding+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Regulatory%2C+Integrative%2C+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Differential role of melanocortins in mediating leptin's central effects on feeding and reproduction.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).</li>
<li>Gottsch, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+kisspeptins+in+the+regulation+of+gonadotropin+secretion+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse.</a> Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).</li>
<li>Krasnow, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+galanin-like+peptide+in+the+integration+of+feeding%2C+body+weight+regulation%2C+and+reproduction+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse.</a> Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).</li>
</ol>

Авторам нечего раскрывать.

Здесь описано простое и эффективное средство для проведения инъекций ICV мышам. Поскольку этот метод не требует стереотаксической рамки, такой подход к централизованной доставке лекарств и экспериментальных агентов доступен большему количеству исследователей. Кроме того, этот подход является относительно высокопроизводительным, поскольку процедура подготовки и инъекции может быть выполнена быстро.
Поскольку эта процедура требует манипуляций иглами и стеклянным шприцем вручную с использованием приблизительных расстояний, рекомендуется начинающему практикующему врачу посвятить некоторое время отработке движений перед работой с живыми животными. Кроме того, трупы мышей могут быть полезны для отработки идентификации брегмы с помощью иглы. Как только вы обретете некоторую уверенность в движении, вам поможет опыт работы с преданными живыми животными. Во время практических занятий инъекция 3 мкл индийских чернил облегчает визуальную оценку места инъекции. Правильно поставленные инъекции приведут к появлению черного цвета в ипсилатеральном боковом желудочке, а также часто в третьем желудочке и контралатеральном боковом желудочке. Инъекция чернил является терминальной процедурой, и мышам не следует позволять оправляться от анестезии после инъекции чернил. Даже опытным практикующим врачам может быть полезно несколько раз отрепетировать боковое движение 2 мм и 1 мм каудального движения перед тем, как сделать инъекцию. Кроме того, важно держать стеклянный шприц вертикально при помещении в мозг. С практикой можно ожидать, что >75% инъекций будут сделаны правильно. Удержание иглы на месте в течение ~1 минуты после введения полного объема может помочь предотвратить обратный отток жидкости из мозга. В течение этого времени важно удерживать иглу в правильном положении без движения. Успешное выполнение этой процедуры требует опыта надежного манипулирования и удержания иглы и стеклянного шприца.
Если некоторые инъекции размещены неправильно, существует несколько вариантов устранения неполадок. Во-первых, убедитесь, что инъекционная игла прямая (не изогнутая) и что игла плотно закреплена на стеклянном шприце. Далее, если пропущенные инъекции различаются по своему расположению, требуется дополнительная практика манипуляций и удержания стеклянного шприца. Также может быть полезно присутствие дополнительного человека, который будет следить за тем, удерживается ли шприц вертикально во время инъекции. Обнаружение брегмы на неповрежденной коже с помощью иглы также требует практики. Настоятельно рекомендуется потратить время на то, чтобы уверенно определить этот ориентир, прежде чем приступать к инъекции. Если инъекции постоянно размещаются в неправильном месте, то необходимо изменить координаты инъекции. Описанные здесь координаты (±2 мм латерально, 1 мм от хвоста до брегмы) эффективны для взрослых мышей C57/BL6, но эти координаты, возможно, придется скорректировать для других штаммов или возрастных групп.
Несмотря на то, что этот метод может быть очень эффективным для быстрой централизованной доставки агентов, у него есть некоторые ограничения. Так как поршень шприца перемещается вручную, скорость впрыска может быть переменной. Рекомендуется вводить его относительно медленно, чтобы избежать потенциальных нецелевых эффектов давления в желудочковой системе. В этом протоколе рекомендуется объем инъекции 3 мкл; однако в других лабораториях использовался больший объем инъекций (5 мкл)11. В зависимости от измеренного результата может потребоваться корректировка объема и скорости инъекции. Например, молодые мыши могут переносить только меньшие объемы инъекций. Таким образом, рекомендуются предварительные эксперименты для проверки эффектов транспортных средств. Дополнительным ограничением является то, что подтверждение правильности установки инъекции ограничивается несколько субъективной оценкой инъекционного тракта после забора ткани. Путь инъекции виден как в свежезамороженной, так и в перфузионной параформальдегидной ткани, собранной через несколько часов после инъекции ICV (см. изображения в репрезентативных результатах). Если было сделано несколько инъекций, по следам в тракте может быть неясно, была ли каждая инъекция успешно введена.
Такой свободный подход к проведению инъекций ICV требует анестезии. С практикой инъекции можно делать быстро, что приводит к кратковременному (3-5 минут) воздействию анестетика. Побрив голову мыши и выполнив трепанацию черепа (проткнув череп острой иглой) до дня эксперимента, можно сократить время нахождения под наркозом во время эксперимента. Мыши, как правило, полностью восстанавливаются после этого кратковременного воздействия анестезии в течение нескольких минут. Сбор образцов крови с кончика хвоста сразу после анестезии может быть сложной задачей, поэтому забор крови может быть приостановлен на ~30 минут после инъекции, чтобы свести к минимуму стресс у мышей, хотя это не является строго необходимым. Другие лаборатории также успешно измеряли изменения секреции ЛГ (одноразовые образцы) через 30 минут после введения фармакологических агентов с использованием этого метода ICV 1,12. Изменения в опорно-двигательном поведении и поведении при проглатывании в течение 24 ч также были обнаружены после инъекций ICV13, что позволяет проводить долгосрочный мониторинг. Рекомендуется проведение предварительных тестов для определения простоты отбора проб и потенциального влияния анестезии на интересующие исходы.
Подводя итог, можно сказать, что описанная здесь техника инъекций ICV является простым, но мощным методом доставки экспериментальных агентов в мозг. Особые преимущества заключаются в том, что этот подход является быстрым и технически простым и обеспечивает высокий процент успешных инъекций. Более того, поскольку этот метод требует лишь кратковременного воздействия анестезии, его можно комбинировать с множеством других методов, таких как частый забор крови, манипуляции с нейронными цепями или запись in vivo для исследования нейроэндокринных процессов.

Доставка экспериментальных агентов, таких как лекарства1, вирусы2 или клетки3, в мозг часто необходима для нейроэндокринных исследований. Если агент не может легко проникнуть через гематоэнцефалический барьер или цель эксперимента состоит в том, чтобы специально проверить центральные эффекты препарата, важно иметь надежный метод доставки инъекций в мозг. Кроме того, инъекция в внутримозговое (ВЦВ) пространство дает возможность широко распределить агент в головном мозге и обеспечивает большую целевую область, тем самым повышая вероятность успешной инъекции2. 
Распространенный метод проведения инъекций ICV включает в себя установку постоянной внутренней канюли. При таком подходе стереотаксическая рама необходима для позиционирования имеющейся в продаже или изготовленной на заказ канюли, так как канюля приклеена или зацементирована на месте. Часто при выздоровлении через канюлю вводят супрафизиологическую дозу ангиотензина II, и если сразу наблюдается питьевое поведение, то канюля считается правильно поставленной4. Такой подход имеет множество преимуществ, в том числе возможность проведения длительной инфузии и возможность многократного введения одному и тому же животному; Кроме того, если используется ангиотензин II, правильное размещение может быть подтверждено до введения экспериментальных соединений. Тем не менее, существуют некоторые ограничения для установки постоянной канюли, в том числе необходимость дорогостоящего оборудования (стереотаксическая рама), возможность повреждения канюли после установки (например, мыши могут жевать канюлю соседа по клетке) и возможность инфекций вокруг постоянной канюли. Однократные инъекции ICV могут быть сделаны с использованием стереотаксического фрейма3, который, хотя и эффективен, требует значительного воздействия анестезии и, таким образом, может скрывать некоторые острые физиологические и поведенческие эффекты лечения. Кроме того, помещение мышей в стереотаксическую рамку требует существенной подготовки для достижения стабильного положения и предотвращения разрыва слуховых проходов.
Здесь описан устоявшийся метод проведения инъекций свободной рукой у мышей. Этот метод основан на предыдущих отчетах 5,6. Преимущества этой методики в том, что она проста, быстра и не требует специализированного оборудования, такого как стереотаксическая рамка. Как описано ниже, эта процедура включает в себя манипуляции со стеклянным шприцем относительно ориентиров на голове мыши для выполнения инъекций, которые могут быть сделаны быстро и, таким образом, требуют всего нескольких минут газовой анестезии в день эксперимента.

<table><tbody><tr><td>Тупые иглы 18-го калибра</td><td>SAI Infusion</td><td>B18-150</td><td></td></tr><tr><td>Иглы 18-го калибра</td><td>BD Medical</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Спиртовые салфетки</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Настольные прокладки</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-206-62AC22</td><td></td></tr><tr><td>Бетадиновый раствор</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1696484</td><td></td></tr><tr><td>Бупренорфин</td><td>Patterson Vet Supply</td><td>07-892-5235</td><td>Контролируемое вещество</td></tr><tr><td>Eyelube</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-218-8442</td><td></td></tr><tr><td>Стеклянный шприц</td><td>Hamilton</td><td>7634-01</td><td></td></tr><tr><td>Игла для инъекций</td><td>Hamilton</td><td>7803-01</td><td>27 калибр, Маленькая игла Hub RN, тип точки: 4, Длина иглы: 10 см, Угол: 45</td></tr><tr><td>Изофлуран&nbsp; &nbsp;</td><td>Patterson Vet Supply</td><td>07-893-8441</td><td></td></tr><tr><td>Изофлуран вапорайзер</td><td>Vet Equip</td><td>V-10</td><td></td></tr><tr><td>Лабораторная лента</td><td>VWR</td><td>89098-128</td><td></td></tr><tr><td>Медицинский кислород Воздух</td><td></td><td>OX USPEA</td><td></td></tr><tr><td>параформальдегид</td><td>Millipore-Sigma</td><td>8.18715.1000</td><td></td></tr><tr><td>Фосфат буферизованный физиологический раствор</td><td>Fisher Scientific</td><td>J67802. K2</td><td></td></tr><tr><td>PulsaR Software</td><td>с открытым исходным кодом, Университет Отаго</td><td></td><td>См. ссылку 9</td></tr><tr><td>Ruler</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-00-152</td><td></td></tr><tr><td>Силастическая трубка (0,040" I.D.)</td><td>DOW</td><td>508-005</td><td></td></tr><tr><td>Силастическая трубка (внутренний диаметр 0,078 дюйма)</td><td>DOW</td><td>508-009</td><td></td></tr><tr><td>Стерильный физиологический раствор</td><td>VWR</td><td>101320-574</td><td></td></tr><tr><td>Сахароза&nbsp;</td><td>Фишер Сайентифик</td><td>С5-500</td><td></td></tr></tbody></table>

Внутримозговые инъекции в свободную руку у мышей

Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice

Исследование нейроэндокринной системы часто требует доставки лекарств, вирусов или других экспериментальных агентов непосредственно в мозг мышей. Внутримозговая инъекция (ИЦВ) позволяет широко распространять экспериментальный агент по всему мозгу (особенно в структурах вблизи желудочков). В данной статье описаны методы проведения инъекций ICV в свободной руке у взрослых мышей. Используя визуальные и тактильные ориентиры на головах мышей, инъекции в боковые желудочки можно делать быстро и надежно. Инъекции делаются стеклянным шприцем, который экспериментатор держит в руке и размещает на приблизительном расстоянии от ориентиров. Таким образом, данная методика не требует стереотаксического кадра. Кроме того, этот метод требует только кратковременной анестезии изофлураном, что позволяет впоследствии оценить поведение и/или физиологию мышей у бодрствующих, свободно ведущих себя мышей. Инъекция ICV в свободную руку является мощным инструментом для эффективной доставки экспериментальных агентов в мозг живых мышей и может сочетаться с другими методами, такими как частый забор крови, манипуляции с нейронными цепями или запись in vivo для исследования нейроэндокринных процессов.

При успешном выполнении этот метод позволяет быстро доставить экспериментальный агент в желудочковую систему. На рисунке 2А показан профиль пульса лютеинизирующего гормона (ЛГ) у овариэктомированной мыши, получившей инъекцию ICV в виде 3 мкл стерильного изотонического физиологического раствора, носителя для многих фармакологических соединений. Этот пример демонстрирует, что кратковременное воздействие газовой анестезии и введение 3 мкл жидкости в желудочковую систему сами по себе не изменяли пульсирующую секрецию ЛГ. Через 3 ч после инъекции ICV животное усыпляли, а свежезамороженную нервную ткань собирали и разрезали на криостате; Инъекционный тракт четко пересекался с боковым желудочком. Инъекционный тракт также был виден в нервной ткани мышей, перфузионированных фиксатором (10 мл гепаринизированного физиологического раствора с последующим введением 20 мл 4% параформальдегида в фосфатном буфере). Примеры правильно поставленных инъекций показаны на рисунке 2Б. Два примера неправильно поставленных инъекций показаны на рисунке 2С. Примеры правильно (слева) и неправильно размещенных инъекций индийских чернил показаны на рисунке 2D. Инъекция индийских чернил полезна для отработки этой техники, поскольку она позволяет четко визуализировать место инъекции. Поступление красителя как в боковые, так и в третий желудочек можно увидеть при правильно поставленных инъекциях (рис. 2D, слева).
<img alt="Мышиная установка для изофлурановой анестезии со схемами мест инъекций и сборкой шприца." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65324/65324fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Рисунок 1: Изображения, показывающие подготовку оборудования и координаты инъекций для инъекций ICV от руки. (A) Конфигурация рабочей станции для инъекций ICV от руки. (B) Схема для отработки движения, необходимого для введения инъекции ICV 3-4-месячным самкам мышей C57/BL6. (C) Приблизительное расположение брегмы у взрослых мышей. (D) Размещение трубки так, чтобы открыть 3,5 мм кончика иглы для инъекции. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65324/65324fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="График уровней ЛГ во времени после введения физиологического раствора ICV; Изображения среза мозга показывают экспериментальные результаты." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65324/65324fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Рисунок 2: Репрезентативные данные лютеинизирующего гормона и гистологии, относящиеся к инъекциям ICV в свободной руке. (A) Профиль пульса ЛГ до и после инъекции ICV. Точки данных со сплошной черной заливкой представляют импульсы, определенные с помощью изменения формулировки PULSAR10 с параметрами, предложенными в этой ссылке для мыши OVX, и уровнем обнаружения 0,32 нг/мл. (B) Фотографии коронального среза мозга мыши с правильно размещенной инъекцией ICV. (C) Фотографии коронального среза головного мозга мыши с неправильно размещенной инъекцией ICV: инъекционный тракт латеральнее желудочка (слева) и инъекционный тракт дорсально к желудочку (справа). (D) Фотографии коронального среза мозга мыши с правильно размещенной инъекцией ICV индийских чернил (слева) и неправильно размещенной ICV-инъекцией индийских чернил (справа). Примечание: на панелях В и С изображен мозг, перфузированный параформальдегидом, собранный через 3 ч после введения физиологического раствора; на панели D изображены свежие мозги, собранные на сухом льду через 2 мин после введения индийских чернил. Масштабная линейка = 1 мм Пожалуйста, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65324/65324fig02large.jpg" target="_blank">нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Здесь описан простой и быстрый подход к выполнению внутримозговых инъекций мышам с использованием свободного доступа (то есть без стереотаксического устройства).

The investigation of neuroendocrine systems often requires the delivery of drugs, viruses, or other experimental agents directly into the brains of mice. ...

Нас интересует нейронный контроль репродуктивной функции, в частности, то, как мозг регулирует высвобождение гормонов, контролирующих половые железы, как в здоровых условиях, так и в ответ на стресс. Главное преимущество этой методики в том, что она относительно проста и быстра. Введение лекарств в боковой желудочек является отличным способом забрасывания широкой сети при тестировании сигнального пути для поддержки более подробных последующих экспериментов.Еще многое предстоит узнать о нейроэндокринном контроле репродукции, включая молекулярные механизмы генерации импульсов лютеинизирующего гормона, механизмы модуляции частоты пульса во время стресса и генерацию преовуляторного всплеска ЛГ. В будущем мы особенно заинтересованы в интеграции разрозненных результатов в модели.

free-hand-intracerebroventricular-injections-in-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Нейронауки

Аутологичных модель инъекции крови внутримозгового кровоизлияния у мышей, описанные в этом протокол использует двойные технику инъекции, чтобы минимизировать риск рефлюкс крови до иглы трек, не антикоагулянтов в насосной системе, и уничтожает все мертвое пространство и сильфонные трубки в системе.

Инъекции аутологичной крови в модели спонтанного внутримозгового кровоизлияния у мышей

В этой статье показано два совершенно разных методов инъекций: 1) в головном мозге (intracerebroventricular) и 2) системные (внутривенное) введение терапевтических агентов в центральной нервной системы у новорожденных мышей.

Доставка терапевтических агентов Через Intracerebroventricular (ICV) и внутривенного (IV) инъекций у мышей

Это видео демонстрирует опосредованную ommaya внутримозговую инъекцию в мышиной модели. Этот метод позволяет локализовать доставку потенциальных кандидатов в лекарственные препараты и обходит гематоэнцефалический барьер.

Интрацеребровентрикулярная инъекция мышам: опосредованный Ommaya метод прямого введения лекарств для доставки лекарств в церебральные желудочки головного мозга мыши

Источник: Li, D., et al. Прямое интратекальное введение рекомбинантных аденоассоциированных вирусов взрослым мышам. J. Vis. Exp. (2019)В этом видео показана процедура интратекального введения аденоассоциированных вирусов (AAV) в спинномозговую жидкость (ликвор) бодрствующей мыши, охватывающая подготовку шприца, выравнивание позвоночника и точное введение иглы. Этот метод проверяет целевую доставку генов, подтверждая ее потенциал для лечения ЦНС.

Интратекальная доставка вирусов в мышиной модели для лечения заболеваний центральной нервной системы

Здесь мы демонстрируем технику широко распространенной нейронной трансдукции путем внутрижелудочковой инъекции аденоассоциированного вируса в мозг неонатальной мыши.  Этот метод обеспечивает быстрый и простой способ достижения пожизненной экспрессии вирусно доставленных трансгенов.

Интрацеребровентрикулярное Вирусный Инъекция по неонатологии мозга мыши для устойчив и распространен нейронов трансдукции

Животные модели детской болезни могут испытать раннее возникновение и прогрессирование агрессивное заболевание. Клинически значимые доставка терапия для молодых мышах может быть технически сложно. Этот протокол описывает неинвазивный внутривенного метод впрыска для новорожденных мышей в течение первых двух послеродовых дней жизни.

Внутривенных инъекций в новорожденных мышей

Здесь мы описываем простой метод внутримозгового и внутрисосудистого введения вирусных частиц или флуоресцентных микрогранул в мозг новорожденной мыши. Характер локализации вируса и наночастиц может быть обнаружен с помощью микроскопической оценки или гибридизации in situ.

Интрацеребровентрикулярное и внутрисосудистой инъекции вирусных частиц и флуоресцентных микрогранул в неонатальном мозга

Здесь мы описываем протокол для микроинъекции в грызунов мозга, которая использует иглы кварца. Эти иглы не производят повреждение обнаружено тканей и обеспечить надежную доставку даже в глубоких регионах. Кроме того они могут быть адаптированы к потребностям исследования, индивидуальный дизайн и может быть повторно использован.

Персонализированные иглы для микроинъекций в мозге, грызунов

Микробные метаболиты, полученные из кишечника, имеют многогранные эффекты, приводящие к сложному поведению у животных. Мы стремимся предоставить пошаговый метод для очерчивания эффектов микробных метаболитов, полученных из кишечника, в мозге через внутрицеребровентрикулярную доставку через направляющую канюлю.

Интрацеребровентрикулярная доставка кишечных микробных метаболитов у свободно движущихся мышей

В настоящем протоколе изложены пошаговые инструкции по выполнению интратекальных инъекций новорожденным мышам для редактирования генов и доставки лекарств.

Интратекальная инъекция новорожденной мыши для редактирования генома и доставки лекарств

Атаксии спиномозжечковых полиглутаминов вызываются экспансиями CAG, производящими белки, склонные к агрегации. Этот протокол описывает производство векторов, стереотаксичную доставку и анализ включений и потери нейронных маркеров, предоставляя контролируемую платформу для изучения механизмов и оценки таргетной терапии нейродегенеративных заболеваний.

Лентивирально-индуцированная стриатальная патология как доклиническая модель полиглутаминной спиномозжечковой атаксии

Узнайте метод свободной руки для внутримозговых инъекций у мышей без стереотаксического аппарата. Этот подход позволяет исследовать нейроэндокринный контроль репродуктивной функции и регуляцию гормонов при стрессе.

Внутримозговые инъекции в свободную руку у мышей

Больше видео