Выделение ядер из клеток-предшественников сердца мышей для профилирования эпигенома и экспрессии генов при одноклеточном разрешении
May 12th, 2023
Здесь мы представляем протокол, описывающий подготовку ядер клеток. После микродиссекции и ферментативной диссоциации сердечной ткани на отдельные клетки клетки-предшественники замораживали с последующим выделением чистых жизнеспособных клеток, которые использовали для секвенирования одноядерной РНК и одноядерного анализа на транспозаз-доступный хроматин с высокопроизводительным анализом секвенирования.
Основной целью данного протокола является изучение взаимодействия генетических факторов и факторов окружающей среды в контексте развития сердца и их вклада в врожденные пороки сердца. Одноядерные подходы, такие как одноядерный РНК-секвенирование и одноядерный атаксический, становятся ключевыми методами изучения клеточной гетерогенности в здоровье и болезнях во время развития сердца. Одним из ограничивающих этапов этих экспериментов является то, что все образцы должны выполняться одновременно.
При работе со всеми экспериментальными условиями сбор достаточно свежего материала для всех условий одновременно может быть сложной задачей. Несмотря на то, что в последние годы был достигнут значительный прогресс в области одиночных клеток, основная трудность заключается в обработке свободных образцов. Избегание трудностей чрезвычайно полезно для выявления молекулярного механизма, лежащего в основе врожденных пороков сердца.
Этот протокол описывает шаги, которые необходимо выполнить для успешного выделения высококачественных ядер из замороженной суспензии сердечных клеток, полученной из эмбрионов мышей. И наш протокол совместим с нисходящими одноядерными РНК-секвенированием и одноядерными атаксическими. Мы надеемся, что эта процедура поможет заинтересованным исследователям и побудит их использовать этот мощный метод для своих исследований.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Этот протокол описывает подготовку клеточных ядер из сердечной ткани для исследования развития сердца и врожденных пороков сердца. Он подчеркивает важность подходов с использованием одиночных ядер для понимания клеточной гетерогенности в условиях здоровья и болезни.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Кардиология
- Клеточная гетерогенность
- Врожденные пороки сердца
Фон
- Сеquencing РНК одиночных ядер является ключевым методом для исследования развития сердца.
- Понимание генетических и экологических взаимодействий имеет решающее значение для решения врожденных пороков сердца.
- Обработка свежих образцов остается значительной проблемой в этих исследованиях.
- Идентификация молекулярных механизмов, лежащих в основе врожденных сердечно-сосудистых заболеваний, важна для развития лечения.
Цель исследования
- Исследовать взаимодействие генетических и экологических факторов в развитии сердца.
- Внести вклад в понимание врожденных пороков сердца.
- Использовать подходы с одиночными ядрами для изучения клеточной гетерогенности.
Использованные методы
- Микродиссекция сердечной ткани.
- Энзиматическая диссоциация для получения одиночных клеток.
- Замораживание и изоляция жизнеспособных прогениторных клеток.
- Сеquening РНК одиночных ядер и анализы доступности хроматина.
Основные результаты
- Успешная подготовка чистых жизнеспособных клеточных ядер.
- Понимание клеточной гетерогенности в процессе развития сердца.
- Идентификация молекулярных механизмов, связанных с врожденными пороками сердца.
- Демонстрация возможности использования подходов с одиночными ядрами в исследованиях сердца.
Выводы
- Техники с одиночными ядрами эффективны для исследования развития сердца.
- Понимание клеточной гетерогенности жизненно важно для решения врожденных пороков сердца.
- Необходимы дальнейшие исследования для усовершенствования этих методов и улучшения обработки образцов.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Single-nucleus isolation from frozen mouse cardiac progenitor cells enables high-resolution epigenomic and transcriptomic profiling, overcoming the limitations of fresh tissue requirements. This capability supports robust investigation of cellular heterogeneity and regulatory mechanisms in heart development, directly impacting early discovery and target validation for congenital heart disease. Flexible sample handling and compatibility with dual-omics platforms enhance portfolio-wide experimental design and data integration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene regulatory networks in cardiac progenitor populations.
- Supports functional target validation by linking chromatin state to gene expression at single-cell resolution.
- Facilitates mechanistic de-risking of candidate pathways implicated in congenital heart defects.
- Improves predictive confidence in early-stage cardiac disease models.
Screening & Assay Development
- Provides high-quality nuclei preparations suitable for standardized snRNA-seq and snATAC-seq workflows.
- Reduces technical variability by allowing batch processing of frozen samples across experimental conditions.
- Enables reproducible quantitative outputs for downstream compound or genetic perturbation screens.
- Supports scalable integration with microfluidic and high-throughput sequencing platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant cardiac progenitor systems.
- Maintains translational continuity from discovery through preclinical validation by preserving sample integrity.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust single-cell data.
- Supports identification of translational biomarkers for congenital heart disease research.
Pipeline & Workflow Integration
This nuclei isolation protocol positions itself at the interface of early discovery and preclinical research, enabling dual-omics profiling from frozen cardiac samples and supporting iterative hypothesis testing across the discovery continuum.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven analysis of gene expression and chromatin accessibility in cardiac progenitors.
- Screening: Delivers reproducible nuclei inputs for high-throughput sequencing assays.
- Analytics: Provides quantitative single-nucleus data for comparative condition analysis.
- Translational Research: Preserves disease-relevant cellular states for biomarker and mechanism studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable workflow for cardiac single-nucleus studies across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac target validation.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible, and scalable nuclei isolation from frozen samples.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Enhances risk-adjusted prioritization and cross-study data integration for cardiac research programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, cell handling, and nuclei isolation techniques.
- Demands access to microfluidic platforms and high-throughput sequencing infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and viability assessment protocols.
- Adaptable to various cardiac developmental stages and experimental models.
- Dependent on rigorous quality control of nuclei integrity and viability prior to sequencing.
