Очистка хроматина локуса гена с одной копией у Saccharomyces cerevisiae
17 ноября 2023 г.
В этом протоколе представлен локусоспецифический метод выделения хроматина, основанный на сайт-специфической рекомбинации, для очистки однокопийного гена, представляющего интерес в его нативном контексте хроматина, от почковавшихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Эукариотическое ядро очень переполнено многими биологическими процессами, происходящими одновременно. Цель нашего исследования состоит в том, чтобы понять, как все эти процессы координируются в наших геномах без серьезных происшествий, которые в противном случае привели бы к геномной нестабильности и заболеваниям человека. Этот протокол позволяет нам очистить конкретный локус генома в его нативном состоянии, что позволяет как композиционную, так и функциональную характеристику выделенного материала, например, измерять взаимодействия белковой ДНК.
Этот протокол обеспечивает огромный уровень обогащения целевого локуса, что позволяет преодолеть многие существующие ограничения локус-специфического выделения хроматина. Материал не был сшит. Это также позволяет проводить многие последующие функциональные анализы, такие как транскрипция in vitro или репликация in vitro.
Этот протокол позволил нам вырезать и очистить различные источники репликации из хромосом дрожжей, что позволило нам провести протеомный анализ и идентифицировать факторы взаимодействия хроматина нового происхождения и, следовательно, продвинуть область исследований репликации ДНК. Этот протокол позволяет проводить исследования репликации in vitro с использованием очищенного исходного материала для изучения состояний хроматина, модификаций гистонов и выполнения структурного анализа нативных нуклеосомных матриц из эндогенных хромосом, продвигая исследования хроматина.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе представлен метод локус-специфичного выделения хроматина из ядра эукариотической клетки, в частности, на примере однокопийного генного локуса у пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Метод позволяет очистить данный локус в его нативном хроматиновом контексте, что облегчает изучение белково-нуклеиновых взаимодействий.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология хроматина
- Геномная стабильность
- Белок-нуклеиновые взаимодействия
Теоретические сведения
- Ядро эукариотической клетки характеризуется высокой плотностью протекающих в нем различных биологических процессов.
- Понимание координации этих процессов имеет решающее значение для предотвращения геномной нестабильности.
- Данный протокол устраняет недостатки существующих методов выделения хроматина.
- Он позволяет анализировать материал без использования сшивающих агентов, что обеспечивает сохранение функциональной активности.
Цель исследования
- Для очистки специфического геномного локуса в его нативном состоянии.
- Для обеспечения возможности композиционного и функционального анализа изолированного хроматина.
- Для облегчения последующих анализов, таких как транскрипция и репликация in vitro.
Используемые методы
- Сайт-специфическая рекомбинация для изоляции хроматина.
- Очистка локуса однокопийного гена.
- Измерение белок-нуклеиновых взаимодействий.
- Функциональный анализ материала без сшивания.
Основные результаты
- Было достигнуто значительное обогащение целевого локуса.
- Функциональная характеристика изолированного хроматина прошла успешно.
- Последующие анализы были упрощены за счет отсутствия артефактов сшивки.
- Данный метод преодолевает ограничения предыдущих методов выделения хроматина.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод локус-специфической изоляции хроматина.
- Он расширяет понимание геномных процессов в нативном контексте.
- Будущие области применения могут включать различные виды функционального анализа в геномных исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Точная изоляция локусов однокопийных генов в нативном состоянии хроматина позволяет напрямую исследовать белково-нуклеиновые взаимодействия и состав хроматина, устраняя критический барьер на этапах первичного поиска и валидации мишеней. Данный метод обеспечивает непредвзятый количественный анализ локус-специфичного хроматина, повышая достоверность прогнозов для снижения механистических рисков и приоритизации портфеля разработок. Эффективное обогащение и сохранение нативной архитектуры хроматина обеспечивают непрерывность трансляционного перехода от этапа открытия к доклиническим исследованиям.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить прямой композиционный и функциональный анализ хроматина в конкретных геномных локусах.
- Обеспечивает идентификацию и количественную оценку белково-нуклеиновых взаимодействий, имеющих значение для валидации мишеней.
- Способствует механистическому снижению рисков за счет сохранения нативного позиционирования нуклеосом и модификаций гистонов.
- Предоставляет платформу для объективных протеомных и структурных исследований на уровне одного локуса.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение высокоочищенного некросслинкированного хроматина, подходящего для последующих функциональных анализов.
- Повышает воспроизводимость и стандартизацию анализа за счет выделения нативных матриц хроматина.
- Позволяет количественно измерять специфические для локуса ассоциации белков для оценки готовности к скринингу.
- Поддерживает масштабируемые рабочие процессы для систематической идентификации факторов хроматина.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет анализ состояния хроматина с релевантными заболеванию геномными локусами для трансляционных исследований биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации, позволяя проводить исследования репликации и транскрипции in vitro.
- Снижает биологические риски, предоставляя нативные шаблоны для структурного и биохимического анализа.
- Способствует принятию обоснованных решений о продвижении исследований с учетом рисков на основе данных о состоянии хроматина в конкретных локусах.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод очистки локус-специфического хроматина интегрируется в непрерывный процесс от этапа поиска мишеней до доклинических исследований, обеспечивая поддержку при проверке гипотез, изучении механизмов и проведении трансляционных исследований.
- Фундаментальная биология: позволяет проверять гипотезы о составе хроматина и белково-ДНК взаимодействиях в определенных локусах.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты для сравнительного анализа факторов, ассоциированных с хроматином.
- Аналитика: поддерживает использование масс-спектрометрии и методов структурного анализа для систематического сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: связывают локус-специфические состояния хроматина с моделями заболеваний и разработкой биомаркеров.
- Прикладное использование: создает многократно используемую платформу для изоляции хроматина из различных геномных мишеней у дрожжей.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность в биологии хроматина.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированные, масштабируемые и воспроизводимые рабочие процессы выделения хроматина.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработок и осуществлять экономически эффективное управление портфелем.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение программ, нацеленных на хроматин.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области генетики дрожжей, биологии хроматина и методов аффинной очистки.
- Необходим доступ к инфраструктуре для протеомики, масс-спектрометрии и структурного анализа.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимого локус-специфического обогащения.
- Адаптация к другим модельным системам может потребовать оптимизации и валидации протокола.
- Эффективность выделения локуса и расщепления TEV-протеазой должна контролироваться количественно.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:48
Yeast Cell Culture and Cell Harvesting for Single‐Copy Gene Locus Chromatin Purification
3:56
Locus‐Specific Chromatin Purification from Saccharomyces cerevisiae
7:16
TEV Protease‐Mediated Elution and Denaturation Elution of the Chromatin Locus Purified from Saccharomyces cerevisiae
