Методы подтверждения электропорации и трансформации Limosilactobacillus reuteri DSM20016
23 июня 2023 г.
Здесь мы представляем протоколы работы с DSM20016 Limosilactobacillus reuteri , подробно описывающие рост, трансформацию плазмиды, ПЦР колоний, измерение флуоресцентного репортерного белка и ограниченную мини-подготовку плазмиды, а также распространенные проблемы и устранение неполадок. Эти протоколы позволяют измерять репортерные белки в DSM20016 или подтверждать с помощью колонии ПЦР, если репортер не участвует.
L.Reuteri, и, в частности, штамм, DSM20016 является надежным, естественным комменсалом кишечника человека, с большими перспективами для терапевтической доставки и выявления заболеваний во всем желудочно-кишечном тракте. Эта работа поможет позиционировать DSM20016 как шасси синтетической биологии для такого рода приложений. Лактобациллы не имеют специфического модельного организма.
Предпочтительные виды существуют, но они обычно выбираются с уклоном в сторону конкретных исследовательских целей. Вариации в семействе бактерий привели к фрагментированным протоколам, некоторые из которых с итерациями модификаций, восходящими к публикациям. Начинающим людям очень сложно точно отфильтровать, что полезно, а что нет.
Один документ о преобразовании DSM20016 действительно существует, но он не современный. Современные протоколы для других членов семейства Lactobacillales существуют, но они не являются DSM20016. Здесь мы стремимся предоставить простой в использовании, централизованный, модернизированный, полный набор протоколов для DSM20016 электропорации.
Этот набор протоколов предлагает существенную модернизацию по сравнению с предыдущим протоколом разведки DSM20016 и разъясняет некоторые висячие нити, а также подчеркивает части, которые ранее были менее ясными. Набор протоколов также является полным, и специально для DSM20016, штамма, для которого другие протоколы, не относящиеся к DSM20016, не полностью совместимы. Одной из наших главных целей является использование микробов в качестве недорогих датчиков и систем доставки.
Мы сотрудничаем с экспертами по кишечным заболеваниям, чтобы использовать DSM20016 для определения состояния желудочно-кишечного тракта и предоставления терапевтических средств по мере необходимости.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В этой статье представлены протоколы работы с Limosilactobacillus reuteri DSM20016, устойчивым комменсальным микроорганизмом человеческого кишечника. Протоколы включают в себя рост, трансформацию плазмид, колоний PCR и измерение флуоресцентных репортерных белков.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Синтетическая биология
- Здоровье желудочно-кишечного тракта
Фон
- Limosilactobacillus reuteri DSM20016 является естественным комменсальным микроорганизмом человеческого кишечника.
- Эта штамм показывает обещание для терапевтической доставки и обнаружения заболеваний.
- Протоколы в этой области часто фрагментированы и сложны для понимания.
- Цели исследования могут повлиять на выбор видов бактерий.
Цель исследования
- Предоставить ясные протоколы работы с DSM20016.
- Облегчить измерение репортерных белков и подтверждение колоний PCR.
- Рассмотреть распространенные проблемы и решение их в протоколах.
Используемые методы
- Рост Limosilactobacillus reuteri DSM20016.
- Техники трансформации плазмид.
- Колонии PCR для подтверждения генетических модификаций.
- Измерение флуоресцентных репортерных белков.
Основные результаты
- Были установлены успешные протоколы роста и трансформации.
- Колонии PCR подтвердили наличие желаемых генетических конструкций.
- Флуоресцентные репортерные белки были эффективно измерены.
- Были предоставлены руководства по устранению распространенных проблем.
Выводы
- Протоколы улучшают исследовательскую применимость DSM20016.
- Они предоставляют основу для будущих приложений в синтетической биологии.
- Четкие руководства помогают исследователям ориентироваться в фрагментированной литературе.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Centralized, strain-specific electroporation and transformation confirmation protocols for Limosilactobacillus reuteri DSM20016 address a critical gap in synthetic biology chassis development for gut-targeted applications. Standardized workflows reduce ambiguity and enable reproducible engineering of commensal microbes for therapeutic delivery and disease sensing. This positions DSM20016 as a reliable platform for early-stage biopharma R&D targeting gastrointestinal health.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust genetic manipulation of DSM20016 for functional target interrogation.
- Supports biological de-risking by clarifying transformation feasibility in a key commensal strain.
- Facilitates predictive confidence in strain selection for synthetic biology pipelines.
Screening & Assay Development
- Provides validated protocols for preparing DSM20016 as a screening-ready chassis.
- Standardizes transformation and reporter measurement for reproducible assay outputs.
- Enables reliable evaluation of engineered constructs in a disease-relevant system.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered DSM20016 with translational goals for gut-targeted therapeutic delivery.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in gastrointestinal models.
- Reduces risk in advancing engineered commensals toward translational studies.
Pipeline & Workflow Integration
These protocols integrate at the interface of early discovery and assay development, enabling streamlined progression from genetic engineering to functional screening in DSM20016.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway engineering in a commensal chassis.
- Screening: Delivers reproducible transformation and quantitative reporter readouts for downstream workflows.
- Analytics: Enables measurement of transformation efficiency and reporter expression for comparative analysis.
- Translational Research: Provides a foundation for preclinical evaluation of engineered strains in gut-relevant contexts.
- Enterprise Reuse: Establishes DSM20016 as a reusable, standardized platform for synthetic biology R&D.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in commensal engineering.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable protocols for strain manipulation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency in early-stage gut microbiome programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of engineered microbial therapeutics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial genetics and electroporation techniques.
- Needs access to electroporation equipment and plate reader instrumentation.
- Demands cross-team standardization for protocol adoption and troubleshooting.
- May require adaptation for other Lactobacillales strains due to genotypic variation.
- Protocol compatibility is specific to DSM20016 and may not generalize to other strains.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:04
Preparing Limosilactobacillus reuteri DSM20016 Electrocompetent Cells for Electroporation
5:27
Measurement of the Acid‐Resistant Fluorescent Reporter Protein mCherry2
7:03
Confirmation of Plasmid Uptake via Colony PCR
8:45
Mini‐Prep Protocol for Limosilactobacillus reuteri and Confirmation of Plasmid Presence by PCR
