Методы подтверждения электропорации и трансформации Limosilactobacillus reuteri DSM20016
23 июня 2023 г.
Здесь мы представляем протоколы работы с DSM20016 Limosilactobacillus reuteri , подробно описывающие рост, трансформацию плазмиды, ПЦР колоний, измерение флуоресцентного репортерного белка и ограниченную мини-подготовку плазмиды, а также распространенные проблемы и устранение неполадок. Эти протоколы позволяют измерять репортерные белки в DSM20016 или подтверждать с помощью колонии ПЦР, если репортер не участвует.
L.Reuteri, и, в частности, штамм, DSM20016 является надежным, естественным комменсалом кишечника человека, с большими перспективами для терапевтической доставки и выявления заболеваний во всем желудочно-кишечном тракте. Эта работа поможет позиционировать DSM20016 как шасси синтетической биологии для такого рода приложений. Лактобациллы не имеют специфического модельного организма.
Предпочтительные виды существуют, но они обычно выбираются с уклоном в сторону конкретных исследовательских целей. Вариации в семействе бактерий привели к фрагментированным протоколам, некоторые из которых с итерациями модификаций, восходящими к публикациям. Начинающим людям очень сложно точно отфильтровать, что полезно, а что нет.
Один документ о преобразовании DSM20016 действительно существует, но он не современный. Современные протоколы для других членов семейства Lactobacillales существуют, но они не являются DSM20016. Здесь мы стремимся предоставить простой в использовании, централизованный, модернизированный, полный набор протоколов для DSM20016 электропорации.
Этот набор протоколов предлагает существенную модернизацию по сравнению с предыдущим протоколом разведки DSM20016 и разъясняет некоторые висячие нити, а также подчеркивает части, которые ранее были менее ясными. Набор протоколов также является полным, и специально для DSM20016, штамма, для которого другие протоколы, не относящиеся к DSM20016, не полностью совместимы. Одной из наших главных целей является использование микробов в качестве недорогих датчиков и систем доставки.
Мы сотрудничаем с экспертами по кишечным заболеваниям, чтобы использовать DSM20016 для определения состояния желудочно-кишечного тракта и предоставления терапевтических средств по мере необходимости.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлены протоколы работы с Limosilactobacillus reuteri DSM20016, устойчивым комменсалом кишечника человека. Протоколы включают культивирование, трансформацию плазмид, колониальную ПЦР и измерение уровня флуоресцентного репортерного белка.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Синтетическая биология
- Здоровье желудочно-кишечного тракта
Теоретические основы
- Limosilactobacillus reuteri DSM20016 является естественным комменсалом кишечника человека.
- Данный штамм перспективен для терапевтической доставки и диагностики заболеваний.
- Протоколы в этой области часто фрагментированы, и ими сложно пользоваться.
- Цели исследования могут влиять на выбор вида бактерий.
Цель исследования
- Предоставить четкие протоколы работы со штаммом DSM20016.
- Обеспечить возможность количественного определения репортерных белков и подтверждения результатов с помощью колониальной ПЦР.
- Рассмотреть типичные проблемы и способы их решения при выполнении данных протоколов.
Используемые методы
- Культивирование Limosilactobacillus reuteri DSM20016.
- Методы трансформации плазмид.
- Колониальная ПЦР для подтверждения генетических модификаций.
- Измерение флуоресценции репортерных белков.
Основные результаты
- Были установлены протоколы успешного выращивания и трансформации.
- ПЦР-анализ колоний подтвердил наличие искомых генетических конструкций.
- Флуоресцентные репортерные белки были эффективно измерены.
- Были предоставлены рекомендации по устранению наиболее распространенных проблем.
Выводы
- Данные протоколы повышают эффективность использования DSM20016 в исследованиях.
- Они служат основой для будущих приложений в области синтетической биологии.
- Четкие инструкции помогают исследователям ориентироваться в разрозненной литературе.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Централизованные, специфичные для штамма протоколы электропорации и подтверждения трансформации для Limosilactobacillus reuteri DSM20016 восполняют критический пробел в разработке шасси синтетической биологии для применения в кишечнике. Стандартизированные рабочие процессы устраняют неопределенность и обеспечивают воспроизводимый инжиниринг комменсальных микробов для терапевтической доставки и сенсинга заболеваний. Это позиционирует DSM20016 как надежную платформу для ранних этапов биофармацевтических исследований и разработок, направленных на здоровье желудочно-кишечного тракта.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Обеспечивает надежное генетическое манипулирование штаммом DSM20016 для функционального анализа мишеней.
- Способствует снижению биологических рисков за счет уточнения возможности трансформации ключевого комменсального штамма.
- Повышает прогностическую уверенность при выборе штаммов для конвейеров синтетической биологии.
Скрининг и разработка анализа
- Содержит валидированные протоколы подготовки штамма DSM20016 в качестве шасси, готового к скринингу.
- Стандартизирует процессы трансформации и измерения репортерных белков для получения воспроизводимых результатов анализа.
- Обеспечивает надежную оценку модифицированных конструкций в системе, релевантной для изучаемого заболевания.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит модифицированный штамм DSM20016 в соответствие с трансляционными целями по адресной доставке терапевтических средств в кишечник.
- Обеспечивает преемственность процесса от этапа открытия до доклинической валидации на моделях желудочно-кишечного тракта.
- Снижает риски при переходе к трансляционным исследованиям модифицированных комменсалов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данные протоколы объединяют этапы первичного поиска и разработки анализа, обеспечивая оптимизированный переход от генетической инженерии к функциональному скринингу в DSM20016.
- Открывательная биология: обеспечивает проверку гипотез и инженерию путей в комменсальном шасси.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимую трансформацию и количественные показатели репортеров для последующих рабочих процессов.
- Аналитика: позволяет измерять эффективность трансформации и экспрессию репортеров для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: создает основу для доклинической оценки сконструированных штаммов в контексте кишечника.
- Корпоративное повторное использование: утверждает DSM20016 как многократно используемую стандартизированную платформу для исследований и разработок в области синтетической биологии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования и снижает механистическую неопределенность при инженерии комменсальных микроорганизмов.
- Операционная ценность: Предоставляет стандартизированные, воспроизводимые и масштабируемые протоколы манипуляций со штаммами.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала в программах по изучению микробиома кишечника на ранних стадиях.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию разработанных микробных терапевтических средств с учетом рисков.
Особенности внедрения
- Требуется опыт работы в области генетики микроорганизмов и методов электропорации.
- Необходим доступ к оборудованию для электропорации и приборам для считывания планшетов.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для внедрения протокола и устранения неполадок.
- Может потребоваться адаптация для других штаммов Lactobacillales из-за генотипической вариабельности.
- Совместимость протокола специфична для штамма DSM20016 и может быть не применима к другим штаммам.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:04
Preparing Limosilactobacillus reuteri DSM20016 Electrocompetent Cells for Electroporation
5:27
Measurement of the Acid‐Resistant Fluorescent Reporter Protein mCherry2
7:03
Confirmation of Plasmid Uptake via Colony PCR
8:45
Mini‐Prep Protocol for Limosilactobacillus reuteri and Confirmation of Plasmid Presence by PCR
