Клеточный скрининг лекарственных препаратов на наличие ингибиторов аутофагии, связанной с 4B цистеин-пептидазой
30 июня 2023 г.
Здесь мы опишем подробный протокол использования репортерного анализа на основе люциферазы в полуавтоматическом формате скрининга с высокой пропускной способностью.
Основная цель исследований в моей лаборатории состоит в том, чтобы понять регуляцию аутофагии и, в частности, цистеинового протея ATG4 и использовать эти знания для разработки низкомолекулярных ингибиторов, которые нацелены на этот путь, в частности, при таких заболеваниях, как рак поджелудочной железы. Мы используем высокопроизводительные технологии скрининга для определения мишеней для лекарств, а также кандидатов в лекарственные препараты, и мы фокусируемся на семействе цистеиновых протеаз ATG4, потому что считаем, что это очень хорошая лекарственная мишень для различных форм рака. Мы уже давно изучаем представителей семейства ATG4.
Мы сделали важные открытия в области дисфункции этого семейства белков и клеток. Мы также идентифицировали новые посттрансляционные механизмы регуляции членов семейства ATG4 и в настоящее время разрабатываем низкомолекулярные ингибиторы, а также активаторы семейств ATG4 для таких заболеваний, как рак и нейродегенерация. Существует не так много тестов для мониторинга активности протеазы ATG4 в клетках.
Таким образом, мы были одними из первых, кто разработал анализ на основе люциферазы для мониторинга этой активности. И наш анализ довольно необычен, потому что он использует секретируемые, скажем так, клетки, поэтому нам не нужно лицензировать клетки, и мы можем легко адаптировать этот протокол к высокопроизводительным методам скрининга и автоматизации лаборатории. Мы уже довольно давно сосредоточились на протеазе белка ATG4 B.
Мы сгенерировали нокаутные клеточные линии членов семейства ATG4. Мы идентифицировали новые механизмы посттрансляционной регуляции ATG4, и, в конечном счете, мы также идентифицировали несколько новых низкомолекулярных соединений, которые могут ингибировать и даже активировать протеазу ATG4 B. В будущем мы хотели бы продолжить работу над членами семейства ATG4.
Мы думаем, что это довольно многое, что в настоящее время неизвестно и еще предстоит раскрыть. Например, то, как эти белки регулируют аутофагию в нейронах, в настоящее время совершенно не изучено. Мы также хотели бы сосредоточить нашу работу на валидации этих низкомолекулярных соединений, которые мы идентифицировали, и, возможно, использовать активаторы при нейродегенеративных заболеваниях.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Данное исследование сосредоточено на регуляции аутофагии, в частности на роли семейства цистеиновых протеаз ATG4 при раке и нейродегенеративных заболеваниях. Исследователи разработали анализ на основе люциферазы для мониторинга активности ATG4, адаптировав его для высокопроизводительного скрининга, что способствует идентификации низкомолекулярных ингибиторов.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Регуляция аутофагии
- Исследования рака
- Нейродегенеративные заболевания
Теоретическая база
- Считается, что семейство протеаз ATG4 является перспективной мишенью для лекарственной терапии различных видов рака.
- Методы мониторинга активности протеазы ATG4 в клетках ограничены.
- Понимание посттрансляционной регуляции ATG4 имеет решающее значение для разработки терапевтических средств.
Используемые методы
- Репортерные анализы на основе люциферазы
- Клеточные линии с нокаутом членов семейства ATG4
- Технологии высокопроизводительного скрининга с высоким содержанием данных
Основные результаты
- Значимые открытия, касающиеся дисфункции белков семейства ATG4 в клетках.
- Идентификация новых низкомолекулярных соединений, ингибирующих или активирующих протеазу ATG4 B.
- Валидированные посттрансляционные регуляторные механизмы ATG4.
Выводы
- Данное исследование закладывает основу для дальнейшего изучения роли ATG4 в регуляции аутофагии.
- Полученные результаты могут привести к разработке новых терапевтических подходов к лечению заболеваний, связанных с нарушением функции аутофагии.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Высокопроизводительный клеточный скрининг ингибиторов ATG4B отвечает критической потребности в разработке онкологических препаратов, обеспечивая функциональную валидацию мишени при модуляции аутофагии. Анализ на основе люциферазы представляет собой масштабируемую количественную платформу для идентификации и отбора низкомолекулярных модуляторов ATG4B, что напрямую влияет на принятие решений по портфелю препаратов на ранних этапах. Данный подход повышает прогностическую уверенность в связывании с мишенью и способствует снижению механистических рисков при разработке средств для лечения рака и нейродегенеративных заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Позволяет напрямую исследовать функцию ATG4B в системах живых клеток для валидации мишеней.
- Обеспечивает снижение механистических рисков путем количественного определения активности протеазы в моделях, релевантных заболеванию.
- Способствует приоритизации мишеней, связанных с аутофагией, на основе функциональных показателей.
Скрининг и разработка анализа
- Предлагает надежный анализ на основе люциферазы, который можно адаптировать для платформ высокопроизводительного скрининга.
- Обеспечивает количественные, воспроизводимые результаты для сортировки соединений и валидации хитов.
- Оптимизирует стандартизацию и масштабируемость анализа для крупномасштабных кампаний по скринингу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует путям аутофагии, имеющим значение для развития рака и нейродегенеративных заболеваний.
- Обеспечивает непрерывность процесса от ранних этапов поиска до доклинической валидации модуляторов ATG4B.
- Поддерживает движение по разработке кандидатов с подтвержденным механизмом действия с учетом сопутствующих рисков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ на основе люциферазы интегрируется в общий процесс разработки — от валидации мишени до идентификации ведущих соединений и доклинической оценки модуляторов аутофагии.
- Биология открытий: Количественная оценка активности ATG4B для проверки гипотез и уточнения путей передачи сигнала.
- Скрининг: Обеспечение готовности и воспроизводимости анализа для высокопроизводительной оценки соединений.
- Аналитика: Получение количественных показателей для сравнительного анализа эффективности ингибиторов.
- Трансляционные исследования: Связующее звено между этапом открытий и доклиническими исследованиями путем обеспечения функциональной валидации в соответствующих моделях заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: Предоставление универсальной платформы для скрининга как ингибиторов, так и активаторов мишеней, связанных с аутофагией.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает уверенность в прогнозировании ATG4B как терапевтической мишени и снижает неопределенность механизмов действия.
- Операционная ценность: Улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов скрининга.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет раннего снижения биологических рисков.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение кандидатов, нацеленных на аутофагию.
Особенности реализации
- Требуется опыт в разработке клеточных анализов и в биологии аутофагии.
- Необходим доступ к оборудованию для высокопроизводительного скрининга и системам детектирования люциферазы.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов анализа и обработки данных.
- Может потребоваться адаптация для различных типов клеток или моделей заболеваний.
- Результат зависит от надежных контролей для обеспечения специфичности активности ATG4B.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
3:18
Autophagy Protease Tag‐Compound Addition and Cellular Supernatant Harvest for Drug Screening
5:01
Luciferase Assay for the Detection of Autophagy Protease ATG4B
7:12
Image Acquisition and Analysis for the Detection of Autophagy Protease ATG4B Using Luciferase Assay
