Двойная иммунофлуоресценция γH2AX и 53BP1 в периферических лимфоцитах человека
14 июля 2023 г.
В этом протоколе представлен метод оценки образования и репарации двухцепочечных разрывов ДНК путем одновременного обнаружения очагов γH2AX и 53BP1 в интерфазных ядрах периферических лимфоцитов человека, обработанных блеомицином.
Цель данной рукописи состояла в том, чтобы оценить пригодность одновременного количественного определения очагов Gamma H2AX и 53BP1 для оценки геномного повреждения, индуцированного блеомицином в периферических лимфоцитах человека. Несколько факторов могут вызвать разрывы двойной пряди. Таким образом, клетки снабжены несколькими механизмами репарации, включающими как Gamma H2AX, так и 53-связывающий белок 1, которые могут совместно локализоваться вблизи разрыва двойной цепи.
После сбора образцов цельной крови добавьте 300 микролитров образца в пробирку, содержащую 4,7 миллилитра полной среды. Затем добавьте пять микрограммов на миллилитр конечной концентрации сульфата блеомицина. Для каждого образца настройте отрицательный контроль.
Поместите трубку в термостат при температуре 37 градусов Цельсия на два часа. Центрифуга пробы при 540 г в течение пяти минут. Затем добавьте в гранулу пять миллилитров гипотонического раствора.
Затем добавляют 400 микролитров предварительно фиксирующего раствора, чтобы вызвать гемолиз. Центрифугу пробуют при 540 G в течение пяти минут, затем ресуспендируют гранулы в пяти миллилитрах метанола при комнатной температуре в течение не менее 30 минут для фиксации ячеек. Центрифугу пробуют при 540 г в течение пяти минут, затем ресуспендируют гранулы в пяти миллилитрах фиксирующего раствора.
Повторите этот шаг еще раз. Снова центрифугу при 540 г в течение пяти минут, затем вдохните надосадочную жидкость, оставив достаточно раствора для ресуспендирования гранул. Бросьте ресуспендированную гранулу ячейки на предметные стекла.
Приготовьте два раствора, содержащие первичные антитела против Gamma H2AX и анти-53BP1, растворенные в блокирующем растворе. Затем вымойте предметные стекла два раза в PBS 1X. Затем держите слайды в течение 30 минут в блокирующем растворе.
Добавьте к каждому предметному стеклу по 10 микролитров каждого из двух растворов, содержащих первичные антитела, растворенные в блокирующем растворе. Накройте слайды парапленкой. Инкубировать при четырех градусах Цельсия в течение ночи.
После инкубации выполните три промывки в PBS 1X в течение пяти минут. Приготовьте два раствора, содержащие вторичные антитела DyLight 488 и Alexa Fluor 568, растворенные в блокирующем растворе. Затем добавляют к каждому предметному стеклу по 10 микролитров каждого из двух растворов, содержащих вторичные антитела, растворенные в блокирующем растворе.
Накройте предметные стекла парапленкой и выдерживайте при комнатной температуре в течение двух часов. После этой второй инкубации выполните три промывки в PBS 1X в течение пяти минут. Перед сборкой добавьте 2,5 микролитра раствора Antifade с DAPI на покровных листах, чтобы противостоять окрашиванию ядер.
Для того, чтобы оценить кинетическую направленность очагов, процедура такая же, как сейчас описана. Последним этапом является наблюдение и количественная оценка очагов. Лимфоциты человека без очагов Gamma H2AX и 53BP1 показаны в А, в В и в С, показаны лимфоциты человека с различным количеством очагов Gamma H2AX и 53BP1.
Наблюдается низкий уровень колокализации очагов. Как и ожидалось, очень высокая частота очагов Gamma H2AX и 53BP1 наблюдается между необработанными необработанными клетками. Также большая разница наблюдается в количестве очагов двух маркеров.
Временной ход фокусов Gamma H2AX и 53BP1 с течением времени показал разное поведение, хотя они вносят свой вклад в одну и ту же функцию. Анализ очагов Gamma H2AX и 53BP1 позволяет оценить клеточный ответ как в условиях воздействия, так и в патологическом контексте. Однако Gamma H2AX и двойная иммунофлуоресценция 53BP1 могут привести к недооценке истинной частоты события.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе представлен метод оценки образования и репарации двухцепочечных разрывов ДНК путем одновременного выявления фокусов γH2AX и 53BP1 в интерфазных ядрах периферических лимфоцитов человека после обработки блеомицином.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Геномика
Теоретические основы
- Двуцепочечные разрывы могут быть индуцированы различными факторами.
- Клетки обладают множеством механизмов репарации повреждений ДНК.
- γH2AX и 53BP1 являются ключевыми белками, участвующими в репарации ДНК.
- Колокализация этих белков происходит вблизи двуцепочечных разрывов.
Цель исследования
- Оценка возможности одновременного количественного определения фокусов γH2AX и 53BP1.
- Оценка повреждений генома в периферических лимфоцитах человека.
- Изучение влияния блеомицина на целостность ДНК.
Используемые методы
- У людей собирают образцы цельной крови.
- Образцы обрабатывают сульфатом блеомицина.
- Для сравнения устанавливают отрицательные контроли.
- В ядрах интерфазы проводят детектирование фокусов γH2AX и 53BP1.
Основные результаты
- Возможна одновременная детекция фокусов γH2AX и 53BP1.
- Обработка блеомицином приводит к измеримому повреждению ДНК.
- Количественная оценка фокусов коррелирует со степенью повреждения генома.
- Результаты подтверждают применимость данного метода для оценки механизмов репарации ДНК.
Выводы
- Данный протокол позволяет эффективно оценить формирование и восстановление двуцепочечных разрывов ДНК.
- Одновременное детектирование γH2AX и 53BP1 дает ценную информацию.
- Этот метод может быть применен в различных исследованиях повреждений и репарации ДНК.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для профильной индустрии
Количественное определение маркеров двуцепочечных разрывов (DSB) ДНК γH2AX и 53BP1 в лимфоцитах человека позволяет точно оценить повреждение генома и кинетику репарации. Этот метод двойной иммунофлуоресценции повышает достоверность прогнозов при раннем скрининге генотоксичности и механистическом снижении рисков для исследуемых соединений. Интеграция этих показателей на этапе поиска поддерживает принятие решений по портфелю с учетом рисков и обеспечивает трансляционную преемственность.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую исследовать пути ответа на повреждение ДНК в клетках человека.
- Способствует механистическому снижению рисков путем количественного определения индукции двухцепочечных разрывов (DSB) и кинетики их восстановления.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней, участвующих в обеспечении стабильности генома.
- Повышает прогностическую достоверность в отношении генотоксичности соединений-лидеров.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает валидированную систему для количественного определения маркеров повреждения ДНК в первичных клетках человека.
- Позволяет получать воспроизводимые количественные данные о двухцепочечных разрывах (DSB), индуцированных соединениями.
- Поддерживает стандартизацию анализа для высокопроизводительного скрининга модуляторов повреждения ДНК.
- Облегчает надежную оценку профилей безопасности соединений на ранних этапах скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Согласует количественное определение маркеров повреждения ДНК со стратегиями разработки трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность этапов от поиска соединений in vitro до доклинической оценки безопасности.
- Позволяет осуществлять риск-ориентированный отбор кандидатов с благоприятными профилями репарации ДНК.
- Предоставляет понимание механизмов клеточного ответа, имеющих значение для патологии и терапии.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод двойной иммунофлуоресценции применяется на этапе от ранних поисковых исследований до доклинических испытаний, позволяя проводить анализ повреждения и репарации ДНК в лимфоцитах человека на основе выдвинутых гипотез.
- Биологические исследования: Количественная оценка фокусов маркеров DSB для выяснения задействованных путей репарации ДНК и снижения биологических рисков.
- Скрининг: Обеспечение воспроизводимых количественных данных для профилирования генотоксичности соединений.
- Аналитика: Измерения динамики фокусов γH2AX и 53BP1 во времени для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: Перенос результатов in vitro в стратегии доклинических биомаркеров ответа на повреждение ДНК.
- Корпоративное повторное использование: Создание универсальной платформы для оценки повреждений ДНК в рамках различных программ по поиску новых лекарственных средств.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при оценке повреждений ДНК.
- Операционная ценность: стандартизирует количественное определение маркеров DSB для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: служит основанием для принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и снижает биологические риски генотоксичности на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию кандидатов с учетом рисков на основе профилей репарации ДНК.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с иммунофлуоресцентной микроскопией и количественным анализом изображений.
- Необходим доступ к валидированным антителам и инфраструктуре для флуоресцентной визуализации.
- Требуется межгрупповая стандартизация протоколов подготовки образцов и количественного анализа.
- Может потребоваться адаптация для различных типов клеток или модельных систем.
- Возможна недооценка истинной частоты DSB из-за ограничений колокализации маркеров.
