Генерация центромер-ассоциированных белков-E CENP-E-/- нокаутных клеточных линий с использованием системы CRISPR/Cas9
23 июня 2023 г.
В данной статье сообщается о построении центромер-ассоциированных протеин-Е (CENP-E) нокаутных клеток с использованием системы CRISPR/Cas9 и трех стратегий скрининга на основе фенотипа. Мы использовали линию нокаутных клеток CENP-E для разработки нового подхода к валидации специфичности и токсичности ингибиторов CENP-E, что полезно для разработки лекарств и биологических исследований.
Генетическая делеция кинезина-7 и CENP обычно приводит к остановке клеточного цикла и гибели клеток. Построение стабильных клеточных линий с нокаутом CENP является важной нерешенной проблемой в биологии CENP. В этом исследовании мы получили нокаутные клетки HeLa CENP с помощью системы CRISPR/Cas9 и разработали три оптимизированные стратегии скрининга.
В последнее время несколько технологий редактирования генома, в том числе нуклеазы с цинковыми пальцами, эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции, и то, как мы производим наши нуклеазы, были разработаны для расщепления геномов в определенном размере. Технология нокаута генов CRISPR/Cas9 произвела революцию в биологии, биотехнологии и медицине. CENP необходим для прикрепления кинетохоров к микротрубочкам и выравнивания хромосом.
Нарушение CENP, будь то путем микроинъекции антител, делеции sgRNC, химического ингибирования или генетической делеции, приводит к смещению хромосом, митотическим дефектам и часто гибели клеток, что усложняет изучение белковых механизмов CENP. В этом исследовании были разработаны три оптимизированные стратегии скрининга, основанные на фенотипах, включая скрининг клеточных колоний, выравнивание фенотипов хромосом и интенсивность флуоресценции белков CENP, что повысило эффективность скрининга и вероятность успеха эксперимента. Важно отметить, что делеция CENP приводит к смещению хромосом, аномальному расположению белков BubR1 и митотическим дефектам.
Режимы взаимодействия и молекулярные механизмы CENP и его ингибиторов являются важными направлениями исследований в клеточной биологии и исследованиях рака. В этом исследовании была установлена клеточная линия HeLa с нокаутом CENP в качестве ценного инструмента для валидации специфичности и токсичности ингибиторов CENP.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен успешный метод получения нокаутных клеток HeLa по гену CENP-E с использованием системы CRISPR/Cas9 и оптимизированных стратегий скрининга. Полученные клеточные линии с нокаутом служат ценной моделью для изучения специфичности и токсичности ингибиторов CENP-E, что способствует совершенствованию разработки лекарственных препаратов и биологических исследований.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Генетика
- Клеточная биология
- Исследования рака
Теоретические сведения
- CENP имеет важное значение для выравнивания хромосом и процессов митоза.
- Предыдущие методы нокаута CENP часто приводили к остановке клеточного цикла и гибели клеток.
- Технология CRISPR/Cas9 изменила подходы к редактированию генов.
Используемые методы
- Технология нокаута генов CRISPR/Cas9
- Клетки HeLa в качестве биологической системы
- Стратегии скрининга на основе фенотипа, включая иммунофлуоресценцию и экстракцию ДНК
Основные результаты
- Увеличение частоты неправильного выравнивания хромосом в клетках с нокаутом CENP-E по сравнению с клетками дикого типа.
- Значительное снижение уровней белка CENP-E, подтвержденное методом иммунофлуоресценции.
- Эффективные методы скрининга позволили оптимизировать вероятность успешной идентификации клеток с нокаутом.
Выводы
- Линия клеток HeLa с нокаутом CENP-E позволяет получить важные сведения о функциях и ингибировании CENP-E.
- Данное исследование углубляет понимание роли CENP в биологии рака и разработке потенциальных терапевтических средств.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Создание линий клеток HeLa с нокаутом CENP-E-/- с помощью системы CRISPR/Cas9 позволяет напрямую исследовать митотические механизмы и проводить валидацию мишеней при поиске антимитотических препаратов. Эта модельная система решает давние проблемы изучения незаменимых белков митоза, предоставляя надежную платформу для оценки специфичности и токсичности ингибиторов CENP-E. Данный подход повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска и идентификации ведущих соединений в онкологических портфелях, нацеленных на пути клеточного деления.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет провести функциональную валидацию CENP-E как мишени в митозе посредством полного нокаута гена.
- Способствует снижению механистических рисков, выявляя прямые фенотипические последствия потери CENP-E.
- Облегчает уточнение путей выравнивания хромосом и биологии контрольной точки веретена деления.
- Повышает прогностическую уверенность при развитии программ по созданию ингибиторов CENP-E.
Скрининг и разработка анализа
- Предоставляет валидированную систему нокаутных клеток для скрининга специфичности и токсичности ингибиторов CENP-E.
- Стандартизирует фенотипические анализы с использованием показателей выравнивания хромосом и интенсивности флуоресценции.
- Обеспечивает воспроизводимую количественную оценку митотических дефектов для анализа соединений.
- Ускоряет разработку методов анализа для платформ высокосодержащего скрининга, направленных на митоз.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит доклинические модели в соответствие с механизмами, имеющими значение для заболевания при делении раковых клеток.
- Способствует идентификации трансляционных биомаркеров путем установления связи между потерей CENP-E и митотическими фенотипами.
- Обеспечивает преемственность от генетической валидации к исследованиям фармакологического ингибирования.
- Снижает риски при разработке ингибиторов митоза за счет подтверждения целевых клеточных эффектов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данная модель клеточной линии с нокаутом интегрируется в континуум исследований: от ранней валидации мишени до идентификации соединений-лидеров и доклинического изучения механизмов действия.
- Открывающая биология: позволяет проверить нулевую гипотезу относительно функции CENP-E в митозе и контроле контрольных точек.
- Скрининг: обеспечивает получение воспроизводимых нокаутных клеток, готовых к анализу, для оценки ингибиторов и фенотипического скрининга.
- Аналитика: предоставляет количественные данные, такие как частота неправильного расположения хромосом и снижение интенсивности флуоресценции.
- Трансляционные исследования: обеспечивает связь между генетической и фармакологической валидацией перспективных антимитотических препаратов.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую клеточную платформу для текущих исследований митотических мишеней и профилирования ингибиторов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования и уменьшает механистическую неоднозначность при валидации митотических мишеней.
- Операционная ценность: Стандартизирует и оптимизирует рабочие процессы фенотипического скрининга ингибиторов митоза.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает возможность принятия обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), а также эффективно распределяет капитал при приоритизации мишеней клеточного деления.
- Влияние на портфель: Поддерживает движение онкологических активов, нацеленных на аппарат митоза, с учетом корректировки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области редактирования генов CRISPR/Cas9 и культивирования клеток млекопитающих.
- Необходим доступ к флуоресцентной микроскопии, секвенированию по Сэнгеру и инфраструктуре для фенотипического скрининга.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов скрининга и валидации.
- Адаптация метода для других клеточных линий или митотических мишеней может потребовать оптимизации протокола.
- Потенциальные ограничения включают ограничения по жизнеспособности клеток и нецелевые эффекты, характерные для моделей нокаута генов.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:16
Transfection, Isolation, and Screening of the CENP‐E Knockout HeLa Cells
6:25
Immunofluorescence Staining and High‐Resolution Confocal Microscopy of CRISPR/Cas9‐Mediated CENP‐E Knockout HeLa Cells
9:29
Chromosome Preparation and Karyotype Analysis of CRISPR/Cas9‐Mediated CENP‐E Knockout HeLa Cells
