Адаптированный микропланшетный анализ на основе оптической плотности для характеристики инфекции актинобактериофагов
30 июня 2023 г.
Описан метод микропланшетов на основе оптической плотности для количественной оценки долгосрочного роста бактерий в присутствии бактериофагов, подходящих для актиномицетов и других медленно растущих бактерий. Этот метод включает в себя модификации для уменьшения испарения и конденсации крышки, а также код R для расчета показателей вирусной инфекции, включая площадь под кривой, максимум роста и относительную вирулентность.
В конечном счете, нас интересуют взаимодействия бактериофага и хозяина. Этот протокол позволяет измерять фаговую инфекцию у медленно растущих бактерий, генерируя описательные показатели инфекции. Эта методология играет важную роль в изучении коэволюции бактериофага и хозяина у медленно растущих бактерий актиномицетов.
Быстрые методы микропланшетов дают отличные результаты для быстрорастущих бактериальных хозяев, но они слишком короткие, чтобы продемонстрировать прогрессирование бактериально-фаговой инфекции у медленно растущих бактериальных хозяев, таких как актиномицеты. Наш метод адаптирован для медленно растущих бактерий, что позволяет совместно культивировать бактерии и фаг в течение нескольких дней, необходимых для характеристики динамики бактериофагальной инфекции. Наш протокол позволяет оценивать взаимодействия бактериофага и хозяина для медленно растущих бактерий в микропланшетах, а не требовать отбора проб из более крупной колбы для культивирования.
Этот протокол использует легкодоступные материалы для адаптации к длительному времени культивирования и позволяет наносить несколько реплик на одну микропланшет.
Обзор
В данном исследовании представлен новый метод анализа оптической плотности в микропланшетах для количественной оценки долгосрочного роста бактерий в присутствии бактериофагов, специально адаптированный для медленно растущих бактерий, таких как актиномицеты. Этот протокол решает проблемы измерения динамики фаговой инфекции у таких бактериальных хозяев, позволяя проводить совместное культивирование в течение длительных периодов и облегчая детальный анализ показателей инфекции.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Взаимодействия бактериофагов и хозяев
- Коэволюция бактерий и бактериофагов
- Количественная оценка роста бактерий
Теоретические основы
- Трудности в изучении медленнорастущих бактерий
- Необходимость в методиках пролонгированного культивирования
- Важность измерения динамики фаговой инфекции
Используемые методы
- Измерение оптической плотности с помощью планшетного ридера
- Медленно растущие актиномицеты в качестве биологической системы
- Применение агарозы для длительного культивирования
Основные результаты
- Разработан метод, подходящий для количественного определения бактериального роста в присутствии фагов
- Получены описательные показатели инфекции, такие как кривые роста
- Определено влияние фаговой инфекции на плотность бактерий
Выводы
- Данное исследование предлагает надежный метод количественной оценки взаимодействий фагов и бактерий у медленно растущих бактерий
- Оно способствует пониманию динамики коэволюции в системах «бактериофаг — хозяин»
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Количественная оценка динамики инфекции бактериофагов у медленно растущих актиномицетов имеет решающее значение для понимания взаимодействий между хозяином и патогеном, а также для снижения рисков на ранних этапах поиска в рамках разработок антимикробных препаратов. Данный адаптированный метод анализа в микропланшетах на основе измерения оптической плотности позволяет проводить высокопроизводительный и воспроизводимый мониторинг показателей инфекции в течение длительных периодов, обеспечивая прогностическую достоверность при валидации мишеней и механистических исследованиях. Масштабируемость данного протокола и количественные результаты делают его ценным ресурсом для систематической оценки систем «фаг-бактерия» в рамках всего портфеля исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить количественный анализ взаимодействий между фагом и хозяином в медленно растущих бактериях.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем измерения прогрессии инфекции и специфичности хозяина.
- Способствует механистическому снижению рисков с помощью описательных показателей инфекции, таких как ингибирование роста и относительная вирулентность.
- Предоставляет данные для обоснования прогностической достоверности и сортировки антимикробных кандидатов.
Скрининг и разработка анализа
- Подготавливает валидированные системы на основе микропланшетов для высокопроизводительного скрининга эффективности фагов.
- Стандартизирует условия анализа для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости результатов между различными лабораториями.
- Обеспечивает получение количественных данных об оптической плотности для надежной оценки соединений или фагов.
- Позволяет реализовывать масштабируемые рабочие процессы с множественными повторностями для эффективного проведения кампаний по скринингу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит показатели инфекции в соответствие с трансляционными конечными точками, имеющими значение для разработки противомикробных препаратов.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации, позволяя проводить долгосрочные исследования инфекций.
- Предоставляет данные с учетом рисков для принятия решений о продвижении препаратов в пайплайнах фаговой терапии.
- Улучшает прогностическое снижение рисков при отборе кандидатов в бактериальных системах, соответствующих данной патологии.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный анализ интегрируется в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, позволяя проверять гипотезы, уточнять сигнальные пути и количественно оценивать показатели инфекции в моделях медленно растущих бактерий.
- Открытия в биологии: Обеспечивает проверку нулевой гипотезы в отношении инфекционности фагов и диапазона хозяев.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные показатели для сравнительного анализа действия фагов или соединений.
- Аналитика: Предоставляет такие метрики инфицирования, как процент ингибирования роста и индекс Стейси-Себальоса, для принятия решений на основе данных.
- Трансляционные исследования: Связывает этап открытий и доклиническую фазу путем моделирования долгосрочной динамики инфекции у соответствующих хозяев.
- Корпоративное повторное использование: Предлагает стандартизированную масштабируемую платформу, адаптируемую к различным системам «фаг-бактерия».
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозов и снижает неоднозначность механизмов в исследованиях взаимодействия фагов и хозяев.
- Практическая ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и пропускную способность анализов на инфицирование.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет предоставления надежных показателей инфицирования.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию и продвижение кандидатов в антимикробные препараты с учетом оценки рисков.
Рекомендации по реализации
- Требуется опыт настройки микропланшетного анализа и измерения оптической плотности.
- Необходим доступ к спектрофотометрическим планшетным ридерам и аналитическим инструментам на базе языка R.
- Требуется межкомандная стандартизация условий анализа и протоколов анализа данных.
- Может потребоваться адаптация для различных моделей медленнорастущих бактерий.
- Контроль испарения и конденсации имеет решающее значение для анализов продолжительного действия.
