Валидируемый анализ капельной цифровой полимеразной цепной реакции для обнаружения аденоассоциированных вирусных векторов в исследованиях биопролития слез

Наш протокол количественно определяет аденоассоциированные вирусные векторы в сложных матрицах. Точное обнаружение и количественная оценка имеют важное значение для оценки их эффективности в клинических испытаниях. Этот протокол, в частности, направлен на заполнение существующих нормативных пробелов в разработке молекулярных исследований, соответствующих надлежащей лабораторной практике.

В рамках разработки вирусных векторов регулирующие органы требуют оценки биовыделения векторов. ddPCR является перспективной технологией для этой оценки, поскольку она позволяет проводить точную количественную оценку без использования стандартной кривой и улучшенной чувствительности по сравнению с кПЦР. Точное количественное определение сложных матриц, встречающихся в клинических условиях, таких как разрывы, может быть сложно проверить из-за интерференции и ингибирования ПЦР.

Ограниченное количество клинических образцов также может ограничивать способность обнаруживать редкие события, если анализ недостаточно чувствителен. Наш подход разрабатывает воспроизводимую и адаптируемую структуру на основе ddPCR для валидации анализов для использования в регулируемых исследованиях. Этот метод позволяет избежать специфического этапа экстракции ДНК, что позволяет проводить более упорядоченную валидацию и предоставляет четкие критерии для оценки эффективности анализа для обеспечения надежности и повторяемости.

Этот протокол может быть применен к любому исследованию выделения вирусного вектора, а не только к обнаружению AAV в слезах, как представлено здесь. Он создает надежную и воспроизводимую структуру, на основе которой могут быть разработаны несколько регулируемых программ, соответствующих назначению.