Экспресс-цитотоксичность рецептора химерного антигена Jurkat in vitro с использованием флуоресцентной визуализации
27 октября 2023 г.
Протокол оценки количественного уничтожения опухолевых клеток клетками Юрката, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (CAR), нацеленный на одиночный опухолевый антиген. Этот протокол может быть использован в качестве скрининговой платформы для быстрой оптимизации шарнирных конструкций CAR перед подтверждением в Т-клетках периферической крови.
CAR-T-клетки постоянно совершенствуются для достижения лучшего ответа в клинических испытаниях на людях. Мы ищем способы оценить это в нашей лаборатории, используя беспристрастный высокопроизводительный метод, например, использование флуоресцентной визуализации для скрининга комбинаций, которые работают лучше всего. Существует несколько комбинаций конструкций, которые могут быть разработаны для любого фрагмента переменной цепи путем изменения геометрии внеклеточного и шарнирного доменов.
Мы разработали этот протокол для выявления комбинаций с наибольшей эффективностью в элиминации клеток-мишеней с помощью клеток Jurkat. Это быстрый, высокопроизводительный протокол скрининга CAR-конструкций на основе цитотоксичности клеток-мишеней с использованием клеток Jurkat, которые затем валидируются обычными Т-клетками. С помощью этой методики можно одновременно протестировать дюжину различных конструкций CAR в 96-луночном планшете.
Здесь, в лаборатории Ахаван, мы количественно оцениваем в абсолютных цифрах прямой циклоз клеток-мишеней с помощью CAR, экспрессирующих клетки Jurkat с высокой пропускной способностью, для скрининга нескольких конструкций CAR. Основной целью нашей лаборатории является улучшение клинической трансляции CAR-T-клеточной терапии опухолей головного мозга высокой степени злокачественности. Мы используем высокопроизводительные скрининги лекарственных препаратов в качестве одного из методов для улучшения цитотоксичности CAR-T-клеток, а также для воздействия на микроокружение опухоли.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан высокопроизводительный метод оценки цитотоксичности экспрессирующих CAR-белки клеток Jurkat в отношении опухолевых клеток. Этот метод позволяет проводить быстрый скрининг различных CAR-конструкций для выявления наиболее эффективных комбинаций для воздействия на специфические опухолевые антигены.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Биология рака
- Клеточная терапия
Теоретические основы
- CAR T-клетки совершенствуются для улучшения клинических результатов.
- Методы высокопроизводительного скрининга необходимы для оптимизации конструкций CAR.
- Клетки Jurkat служат моделью для оценки эффективности CAR.
- Данное исследование сосредоточено на цитотоксичности конструкций CAR в отношении клеток-мишеней.
Цель исследования
- Разработать протокол для эффективного скрининга конструкций CAR.
- Количественно оценить цитотоксический эффект Jurkat-клеток, экспрессирующих CAR.
- Определить оптимальные конфигурации CAR для таргетирования опухолевых антигенов.
Используемые методы
- Флуоресцентная визуализация для высокопроизводительного скрининга.
- Оценка нескольких конструкций CAR в формате 96-луночного планшета.
- Количественное определение гибели целевых клеток клетками Jurkat, экспрессирующими CAR.
- Сравнение с традиционными Т-клеточными ответами для валидации.
Основные результаты
- Идентификация эффективных конструкций CAR для уничтожения опухолевых клеток.
- Демонстрация возможностей высокопроизводительного анализа с использованием клеток Jurkat.
- Количественная оценка цитотоксичности различных конструкций.
- Потенциал для быстрой оптимизации дизайна CAR перед их клиническим применением.
Выводы
- Данный протокол обеспечивает эффективный скрининг конструкций CAR.
- Клетки Jurkat служат надежной моделью для оценки эффективности CAR.
- Этот подход может ускорить разработку методов терапии с использованием CAR-T-клеток.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Быстрая высокопроизводительная оценка цитотоксичности конструкций CAR в клетках Jurkat позволяет на ранних этапах снизить риски и расставить приоритеты при выборе дизайнов CAR перед трудоемкой валидацией на первичных Т-клетках. Эта платформа ускоряет поиск CAR-конструкций с оптимизированным шарнирным участком (hinge), обладающих повышенной способностью к уничтожению клеток-мишеней, что способствует эффективной сортировке портфеля разработок в области онкологической клеточной терапии. Количественное определение цитотоксичности нескольких конструкций одновременно позволяет командам принимать обоснованные решения на критических этапах процесса поиска и разработки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Позволяет быстро исследовать различные варианты конструкции CAR для функциональной валидации мишени.
- Способствует снижению механистических рисков путем количественного определения прямой цитотоксичности в контролируемой системе.
- Обеспечивает прогностическую уверенность при выборе конструкции перед основным этапом инженерии Т-клеток.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных систем CAR-Jurkat для последующих рабочих процессов высокопроизводительного скрининга.
- Стандартизация анализов цитотоксичности с получением количественных данных флуоресцентной визуализации.
- Обеспечение воспроизводимой и масштабируемой параллельной оценки нескольких конструкций CAR.
- Поддержка надежной оценки соединений или конструкций в формате 96-луночных планшетов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Позволяет сопоставить данные о ранней цитотоксичности с трансляционными целями путем подтверждения результатов на Т-клетках, полученных из PBMC.
- Обеспечивает преемственность между этапом оптимизации конструктов при поиске и этапами доклинической валидации.
- Снижает риск потерь на поздних стадиях за счет раннего отсева субоптимальных вариантов дизайна CAR.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Эта высокопроизводительная платформа для анализа цитотоксичности применяется на этапе между начальным поиском и идентификацией ведущих соединений, связывая разработку конструктов с доклинической валидацией. Она позволяет быстро проверять гипотезы и проводить сортировку конструктов перед переходом к ресурсозатратным первичным исследованиям на T-клетках или исследованиям in vivo.
- Открывающая биология: Обеспечивает проверку гипотез при оценке модификаций шарнирного и внеклеточного доменов для повышения эффективности CAR.
- Скрининг: Предоставляет количественные, воспроизводимые данные о цитотоксичности для сравнения и ранжирования конструкций.
- Аналитика: Обеспечивает определение абсолютного количества клеток и статистические результаты (например, однофакторный ANOVA) для принятия обоснованных решений.
- Трансляционные исследования: Подтверждает эффективность конструкций в T-клетках, полученных из PBMC, поддерживая непрерывность трансляционного процесса.
- Корпоративное повторное использование: Создает масштабируемую, многократно используемую платформу для проведения текущих кампаний по оптимизации конструкций CAR.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования и снижает механистическую неопределенность при выборе конструкции CAR.
- Операционная ценность: стандартизирует и масштабирует оценку цитотоксичности, обеспечивая эффективное распределение ресурсов.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет ранней фильтрации конструкций.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию кандидатов CAR и их продвижение с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в дизайне конструкций CAR и лентивирусной трансдукции клеток Jurkat.
- Необходим доступ к оборудованию для флуоресцентной визуализации и аналитическому программному обеспечению для получения количественных данных.
- Требуется межкомандная стандартизация условий проведения анализа и параметров обработки данных.
- Адаптация к другим клеточным моделям или антигенам может потребовать оптимизации протокола.
- Для сравнения конструкций необходим надежный статистический анализ (например, ANOVA).
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:42
Plating CFSE‐Labelled Tumor Cells and Co‐Culturing CAR‐Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation
5:19
Preparation of Plate for Fluorescent Imaging and Cell Viability Assessment in CAR‐Jurkat Co‐Culture with CFSE‐Labeled Tumor Cells
![Динамическая визуализация Т-клеток рецептора химерного антигена с помощью [18F]Тетрафтороборатно-позитронно-эмиссионной томографии/компьютерной томографии](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62334.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A24%253A38.282Z&w=384&q=75)
