Экспресс-цитотоксичность рецептора химерного антигена Jurkat in vitro с использованием флуоресцентной визуализации
27 октября 2023 г.
Протокол оценки количественного уничтожения опухолевых клеток клетками Юрката, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (CAR), нацеленный на одиночный опухолевый антиген. Этот протокол может быть использован в качестве скрининговой платформы для быстрой оптимизации шарнирных конструкций CAR перед подтверждением в Т-клетках периферической крови.
CAR-T-клетки постоянно совершенствуются для достижения лучшего ответа в клинических испытаниях на людях. Мы ищем способы оценить это в нашей лаборатории, используя беспристрастный высокопроизводительный метод, например, использование флуоресцентной визуализации для скрининга комбинаций, которые работают лучше всего. Существует несколько комбинаций конструкций, которые могут быть разработаны для любого фрагмента переменной цепи путем изменения геометрии внеклеточного и шарнирного доменов.
Мы разработали этот протокол для выявления комбинаций с наибольшей эффективностью в элиминации клеток-мишеней с помощью клеток Jurkat. Это быстрый, высокопроизводительный протокол скрининга CAR-конструкций на основе цитотоксичности клеток-мишеней с использованием клеток Jurkat, которые затем валидируются обычными Т-клетками. С помощью этой методики можно одновременно протестировать дюжину различных конструкций CAR в 96-луночном планшете.
Здесь, в лаборатории Ахаван, мы количественно оцениваем в абсолютных цифрах прямой циклоз клеток-мишеней с помощью CAR, экспрессирующих клетки Jurkat с высокой пропускной способностью, для скрининга нескольких конструкций CAR. Основной целью нашей лаборатории является улучшение клинической трансляции CAR-T-клеточной терапии опухолей головного мозга высокой степени злокачественности. Мы используем высокопроизводительные скрининги лекарственных препаратов в качестве одного из методов для улучшения цитотоксичности CAR-T-клеток, а также для воздействия на микроокружение опухоли.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан высокопроизводительный метод оценки цитотоксичности CAR-экспрессирующих клеток Jurkat в отношении опухолевых клеток. Он позволяет проводить быстрый скрининг различных конструкций CAR для выявления наиболее эффективных комбинаций для воздействия на специфические опухолевые антигены.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Биология рака
- Клеточная терапия
Теоретические основы
- CAR T-клетки совершенствуются для улучшения клинических результатов.
- Методы высокопроизводительного скрининга необходимы для оптимизации конструкций CAR.
- Клетки Jurkat служат моделью для оценки эффективности CAR.
- Данное исследование посвящено изучению цитотоксичности конструкций CAR в отношении клеток-мишеней.
Цель исследования
- Разработать протокол для эффективного скрининга конструкций CAR.
- Количественно оценить цитотоксический эффект клеток Jurkat, экспрессирующих CAR.
- Определить оптимальные конфигурации CAR для таргетирования опухолевых антигенов.
Используемые методы
- Флуоресцентная визуализация для высокопроизводительного скрининга.
- Оценка нескольких конструкций CAR в формате 96-луночного планшета.
- Количественное определение гибели клеток-мишеней клетками Jurkat, экспрессирующими CAR.
- Сравнение с традиционными Т-клеточными ответами для валидации.
Основные результаты
- Идентификация эффективных конструктов CAR для уничтожения опухолевых клеток.
- Демонстрация возможностей высокопроизводительного скрининга с использованием клеток Jurkat.
- Количественная оценка цитотоксичности различных конструктов.
- Потенциал для быстрой оптимизации дизайна CAR перед клиническим применением.
Выводы
- Данный протокол позволяет проводить эффективный скрининг конструкций CAR.
- Клетки Jurkat служат надежной моделью для оценки эффективности CAR.
- Этот подход может ускорить разработку методов терапии с использованием CAR T-клеток.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Быстрая высокопроизводительная оценка цитотоксичности CAR-конструктов в клетках Jurkat позволяет снизить риски на ранних этапах и приоритизировать варианты дизайна CAR перед проведением трудоемкой валидации на первичных Т-клетках. Данная платформа ускоряет идентификацию CAR с оптимизированным шарнирным участком (hinge), обладающих повышенной способностью к уничтожению клеток-мишеней, что способствует эффективному отбору перспективных кандидатов в рамках разработки клеточной терапии в онкологии. Количественная оценка цитотоксичности нескольких конструктов одновременно позволяет принимать решения на основе данных в критические моменты этапа поиска и разработки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Обеспечивает возможность быстрого анализа различных вариантов конструкций CAR для функциональной валидации мишени.
- Способствует снижению механистических рисков путем количественной оценки прямой цитотоксичности в контролируемой системе.
- Повышает прогностическую уверенность при выборе конструкции перед основным этапом инженерии T-клеток.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать валидированные системы CAR-Jurkat для последующих этапов высокопроизводительного скрининга.
- Стандартизирует анализы цитотоксичности с получением количественных результатов с помощью флуоресцентной визуализации.
- Обеспечивает воспроизводимую и масштабируемую параллельную оценку нескольких конструкций CAR.
- Обеспечивает надежную оценку соединений или конструкций в формате 96-луночных планшетов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет ранние данные о цитотоксичности с трансляционными целями путем подтверждения результатов на Т-клетках, полученных из PBMC.
- Обеспечивает преемственность от этапа оптимизации конструктов при поиске до этапов доклинической валидации.
- Снижает риск неудач на поздних стадиях за счет раннего отсева субоптимальных вариантов дизайна CAR.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Эта высокопроизводительная платформа для оценки цитотоксичности применяется на этапе между начальным поиском и идентификацией ведущих соединений, связывая разработку конструктов с доклинической валидацией. Она позволяет быстро проверять гипотезы и проводить сортировку конструктов перед переходом к ресурсозатратным первичным исследованиям на Т-клетках или исследованиям in vivo.
- Дискавери-биология: Обеспечивает проверку гипотез при оценке модификаций шарнирного и внеклеточного доменов для повышения эффективности CAR.
- Скрининг: Позволяет получать количественные, воспроизводимые данные о цитотоксичности для сравнения и ранжирования конструктов.
- Аналитика: Предоставляет данные об абсолютном количестве клеток и результаты статистического анализа (например, однофакторный ANOVA) для принятия обоснованных решений.
- Трансляционные исследования: Подтверждают эффективность конструктов в Т-клетках, полученных из PBMC, обеспечивая преемственность трансляционного процесса.
- Корпоративное использование: Создает масштабируемую, многократно используемую платформу для непрерывных кампаний по оптимизации конструктов CAR.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозов и снижает механистическую неоднозначность при выборе конструкции CAR.
- Операционная ценность: стандартизирует и масштабирует оценку цитотоксичности, обеспечивая эффективное распределение ресурсов.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет ранней фильтрации конструкций.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию и продвижение кандидатов CAR с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в дизайне конструкций CAR и лентивирусной трансдукции клеток Jurkat.
- Необходим доступ к оборудованию для флуоресцентной визуализации и аналитическому программному обеспечению для получения количественных данных.
- Требуется межкомандная стандартизация настройки анализа и параметров анализа данных.
- Адаптация к другим клеточным моделям или антигенам может потребовать оптимизации протокола.
- Сравнение конструкций зависит от проведения надежного статистического анализа (например, ANOVA).
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:42
Plating CFSE‐Labelled Tumor Cells and Co‐Culturing CAR‐Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation
5:19
Preparation of Plate for Fluorescent Imaging and Cell Viability Assessment in CAR‐Jurkat Co‐Culture with CFSE‐Labeled Tumor Cells
![Динамическая визуализация Т-клеток рецептора химерного антигена с помощью [18F]Тетрафтороборатно-позитронно-эмиссионной томографии/компьютерной томографии](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62334.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A24%253A38.282Z&w=384&q=75)
