Экспресс-цитотоксичность рецептора химерного антигена Jurkat in vitro с использованием флуоресцентной визуализации
27 октября 2023 г.
Протокол оценки количественного уничтожения опухолевых клеток клетками Юрката, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (CAR), нацеленный на одиночный опухолевый антиген. Этот протокол может быть использован в качестве скрининговой платформы для быстрой оптимизации шарнирных конструкций CAR перед подтверждением в Т-клетках периферической крови.
CAR-T-клетки постоянно совершенствуются для достижения лучшего ответа в клинических испытаниях на людях. Мы ищем способы оценить это в нашей лаборатории, используя беспристрастный высокопроизводительный метод, например, использование флуоресцентной визуализации для скрининга комбинаций, которые работают лучше всего. Существует несколько комбинаций конструкций, которые могут быть разработаны для любого фрагмента переменной цепи путем изменения геометрии внеклеточного и шарнирного доменов.
Мы разработали этот протокол для выявления комбинаций с наибольшей эффективностью в элиминации клеток-мишеней с помощью клеток Jurkat. Это быстрый, высокопроизводительный протокол скрининга CAR-конструкций на основе цитотоксичности клеток-мишеней с использованием клеток Jurkat, которые затем валидируются обычными Т-клетками. С помощью этой методики можно одновременно протестировать дюжину различных конструкций CAR в 96-луночном планшете.
Здесь, в лаборатории Ахаван, мы количественно оцениваем в абсолютных цифрах прямой циклоз клеток-мишеней с помощью CAR, экспрессирующих клетки Jurkat с высокой пропускной способностью, для скрининга нескольких конструкций CAR. Основной целью нашей лаборатории является улучшение клинической трансляции CAR-T-клеточной терапии опухолей головного мозга высокой степени злокачественности. Мы используем высокопроизводительные скрининги лекарственных препаратов в качестве одного из методов для улучшения цитотоксичности CAR-T-клеток, а также для воздействия на микроокружение опухоли.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Этот протокол описывает высокоэффективный метод для оценки цитотоксичности клеток Jurkat, экспрессирующих CAR, по отношению к опухолевым клеткам. Он позволяет быстро исследовать различные конструкции CAR для выявления наиболее эффективных комбинаций по таргетингу специфических опухолевым антигенов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Биология рака
- Клеточная терапия
Предисловие
- Клетки CAR T разрабатываются для улучшения клинических результатов.
- Методы высокоэффективного скрининга необходимы для оптимизации конструкций CAR.
- Клетки Jurkat служат моделью для оценки эффективности CAR.
- Это исследование фокусируется на цитотоксичности конструкций CAR по отношению к целевым клеткам.
Цель исследования
- Разработать протокол для эффективного скрининга конструкций CAR.
- Количественно оценить цитотоксические эффекты клеток Jurkat, экспрессирующих CAR.
- Определить оптимальные конфигурации CAR для таргетинга опухолевым антигенов.
Используемые методы
- Флуоресцентное изображение для высокоэффективного скрининга.
- Оценка множества конструкций CAR в формате 96-луночной пластинки.
- Количественная оценка убийства целевых клеток клетками Jurkat, экспрессирующими CAR.
- Сравнение с традиционными ответами Т-клеток для валидации.
Основные результаты
- Идентификация эффективных конструкций CAR для убийства опухолевым клеток.
- Демонстрация высокоэффективных возможностей с использованием клеток Jurkat.
- Количественная оценка цитотоксичности по разным конструкциям.
- Потенциал для быстрой оптимизации дизайнов CAR до клинического применения.
Выводы
- Протокол позволяет эффективно исследовать конструкции CAR.
- Клетки Jurkat обеспечивают надежную модель для оценки эффективности CAR.
- Этот подход может ускорить разработку терапии клетками CAR T.
Частые вопросы
Executive Industry Relevance
Rapid, high-throughput cytotoxicity evaluation of CAR constructs in Jurkat cells enables early-stage de-risking and prioritization of CAR designs before resource-intensive primary T cell validation. This platform accelerates the identification of hinge-optimized CARs with superior target cell killing, supporting efficient portfolio triage in oncology cell therapy pipelines. By quantifying cytotoxicity across multiple constructs simultaneously, teams can make data-driven decisions at critical discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid interrogation of CAR construct permutations for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying direct cytotoxicity in a controlled system.
- Facilitates predictive confidence in construct selection prior to primary T cell engineering.
Screening & Assay Development
- Prepares validated CAR-Jurkat systems for downstream high-throughput screening workflows.
- Standardizes cytotoxicity assays with quantitative fluorescent imaging outputs.
- Enables reproducible, scalable evaluation of multiple CAR constructs in parallel.
- Supports reliable compound or construct evaluation in 96-well plate formats.
Translational & Preclinical Research
- Aligns early cytotoxicity data with translational goals by confirming findings in PBMC-derived T cells.
- Provides continuity from discovery-stage construct optimization to preclinical validation steps.
- Reduces risk of late-stage attrition by filtering out suboptimal CAR designs early.
Pipeline & Workflow Integration
This high-throughput cytotoxicity platform fits at the interface of early discovery and lead identification, bridging construct design with preclinical validation. It enables rapid hypothesis testing and construct triage before advancing to resource-intensive primary T cell or in vivo studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven evaluation of hinge and extracellular domain modifications for CAR efficacy.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible cytotoxicity data for construct comparison and ranking.
- Analytics: Provides absolute cell counts and statistical outputs (e.g., one-way ANOVA) to inform decision-making.
- Translational Research: Confirms construct performance in PBMC-derived T cells, supporting translational continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for ongoing CAR construct optimization campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CAR construct selection.
- Operational Value: Standardizes and scales cytotoxicity evaluation, enabling efficient resource allocation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by filtering constructs early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CAR candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CAR construct design and lentiviral transduction of Jurkat cells.
- Needs access to fluorescent imaging instrumentation and analytical software for quantitative readouts.
- Demands cross-team standardization of assay setup and data analysis parameters.
- Adaptation to other cell models or antigens may require protocol optimization.
- Dependent on robust statistical analysis (e.g., ANOVA) for construct comparison.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:42
Plating CFSE‐Labelled Tumor Cells and Co‐Culturing CAR‐Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation
5:19
Preparation of Plate for Fluorescent Imaging and Cell Viability Assessment in CAR‐Jurkat Co‐Culture with CFSE‐Labeled Tumor Cells
![Динамическая визуализация Т-клеток рецептора химерного антигена с помощью [18F]Тетрафтороборатно-позитронно-эмиссионной томографии/компьютерной томографии](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62334.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A24%253A38.282Z&w=384&q=75)
