Простой, быстрый и частично автоматизированный протокол выделения одиночных ядер из замороженных тканей млекопитающих для секвенирования одного ядра
28 июля 2023 г.
В исследовании описывается простой, быстрый и частично автоматизированный протокол выделения высококачественных ядер из замороженных тканей млекопитающих для последующего секвенирования одноядерной РНК.
Это исследование направлено на поддержку исследований по открытию лекарств с использованием секвенирования РНК одного ядра для изучения эффективности и безопасности потенциальных методов лечения. Поэтому мы разрабатываем стандартизированные протоколы экстракции ядер для свежезамороженных образцов тканей из различных органов. Наша цель состояла в том, чтобы автоматизировать и стандартизировать экстракцию ядер для достижения стабильных и надежных результатов за счет снижения небиологической изменчивости.
Преимуществом является частичная автоматизация за счет использования робота-диссоциатора и простой и короткий рабочий процесс, который может быть применен к различным образцам тканей разных видов. Наличие стандартизированных протоколов может помочь нам ответить на вопросы о биораспределении лекарств, а также изучить механизмы, лежащие в основе любых сигналов безопасности, которые мы можем наблюдать. В будущем мы будем тестировать применимость нашего протокола для других нисходящих приложений, таких как ATAC-seq или мультиомика.
Мы также попытаемся создать протоколы для обнаружения вирусно экспрессируемых трансгенов в отдельных ядрах.
Обзор
В данной работе представлен стандартизированный и частично автоматизированный протокол выделения высококачественных ядер из замороженных тканей млекопитающих, направленный на повышение эффективности и надежности последующего секвенирования РНК единичных ядер. Данный протокол способствует совершенствованию исследований по поиску новых лекарственных средств за счет снижения небиологической вариабельности.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Секвенирование РНК одиночных ядер
- Исследования по поиску новых лекарственных препаратов
- Высококачественное выделение ядер
Теоретические основы
- Разработка стандартизированных протоколов экстракции ядер
- Особое внимание к образцам свежезамороженных тканей различных органов
- Цель — изучение биораспределения препаратов и сигналов безопасности
Используемые методы
- Частично автоматизированное выделение ядер с использованием роботизированного диссоциатора
- Ткани млекопитающих различных видов
- Применение очистки с использованием градиента сахарозы
Основные результаты
- Высококачественные ядра, полученные без признаков наличия клеточного дебриса или агрегации
- Стабильные результаты для различных типов тканей
- Низкая техническая вариабельность и схожие клеточные пропорции в разных образцах
Выводы
- В данном исследовании успешно автоматизирована и стандартизирована процедура экстракции ядер.
- Этот протокол может оказать значительную помощь в решении биологических вопросов в области поиска новых лекарственных средств и оценки их безопасности.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Стандартизированное выделение одиночных ядер из замороженных тканей обеспечивает надежное транскриптомное профилирование при поиске новых лекарственных средств, поддерживая исследования как эффективности, так и безопасности. Благодаря минимизации небиологической вариабельности за счет частичной автоматизации, данный протокол повышает прогностическую достоверность последующего секвенирования РНК одиночных ядер. Возможность адаптации метода к различным типам тканей делает его универсальным инструментом для снижения механистических рисков и валидации мишеней в масштабе всего портфеля разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет исследовать механизм действия препарата и тканеспецифичную экспрессию генов в архивных образцах или образцах, которые трудно подвергнуть диссоциации.
- Снижает техническую вариабельность, что способствует функциональной валидации мишеней и снижению механистических рисков.
- Обеспечивает воспроизводимую генерацию данных для приоритизации портфеля препаратов на основе выдвинутых гипотез.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет готовить высококачественные суспензии ядер, подходящие для стандартизированных рабочих процессов секвенирования РНК единичных ядер.
- Обеспечивает воспроизводимость анализа и согласованность количественных результатов для различных типов тканей и видов.
- Обеспечивает масштабируемую, частично автоматизированную обработку образцов для надежной оценки соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует анализу тканей при заболеваниях для поиска трансляционных биомаркеров при использовании замороженных или архивных образцов.
- Обеспечивает преемственность от этапа первичного поиска до доклинической валидации, поддерживая исследования на нескольких типах тканей и различных видах.
- Создает основу для будущих применений в области мультиомики и ATAC-seq, как указано в разделе «перспективы» данного протокола.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол объединяет этапы раннего поиска и доклинических исследований, обеспечивая высокоточное транскриптомное профилирование замороженных тканей для идентификации перспективных соединений и изучения механизмов действия.
- Открытия в биологии: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей, позволяя проводить транскриптомный анализ отдельных ядер из различных тканей.
- Скрининг: обеспечивает получение воспроизводимых количественных препаратов ядер для последующего секвенирования.
- Аналитика: предоставляет стандартизированные выходные данные, такие как количество генов, количество UMI и содержание митохондрий, для сравнительного анализа образцов.
- Трансляционные исследования: облегчает анализ биораспределения лекарственных средств и сигналов безопасности в тканях, имеющих отношение к заболеванию.
- Корпоративное повторное использование: предлагает широко адаптируемый протокол для различных типов тканей и видов, поддерживая исследования в масштабе всего портфолио.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает неоднозначность механизмов в транскриптомных исследованиях.
- Практическая ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и частичную автоматизацию рабочих процессов выделения ядер.
- Стратегическая ценность: оптимизирует процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и эффективность использования капитала за счет снижения технической вариабельности.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию и продвижение кандидатов в лекарственные препараты с учетом рисков на основе надежных молекулярных данных.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с тканями, выделением ядер и последующим секвенированием.
- Необходим доступ к роботизированному диссоциатору, автоматическому счетчику флуоресцентных клеток и стандартной инфраструктуре для молекулярно-биологических исследований.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости результатов в различных исследованиях и центрах.
- Метод адаптируем для различных тканей млекопитающих при минимальной оптимизации, что подтверждено на нескольких видах.
- Возможные ограничения включают необходимость корректировки протокола для нестандартных тканей или будущих применений в области мультиомики.
