Измерение митохондриальной функции наивных и эффекторных CD8 Т-клеток
28 марта 2025 г.
Биоэнергетика CD8 Т-клеток может быть исследована с помощью стресс-теста Мито. Эта методология может быть использована для изучения острого и хронического метаболического программирования. В этом протоколе описываются подходы к изучению взаимосвязи между биологией Т-клеточных рецепторов и биоэнергетическим анализом.
Наша лаборатория изучает иммунную толерантность, иммунный надзор и передачу сигналов антигенных рецепторов лимфоцитами. Мы обнаружили, что лизофосфатидная кислота нарушает цитотоксичность CD8 Т-клеток, способствуя периферической толерантности за счет снижения метаболической гибкости в эффекторных клетках. Мы используем технологии для измерения митохондриального метаболизма и энергетических мощностей в CD8 Т-клетках.
Наша лаборатория показала, что лизофосфатидная кислота модулирует метаболическую приспособленность CD8 Т-клеток и может быть важным фактором, определяющим фенотипы Т-клеток. Описанный здесь протокол оценивает функциональный метаболизм и биоэнергетику передачи сигналов Т-клеточных рецепторов в режиме реального времени. Для начала добавьте по 200 микролитров дистиллированной воды в каждую лунку хозяйственной плиты.
Поместите картридж датчика на верхнюю часть рабочей пластины, убедившись, что концы картриджа датчика погружены в воду для обеспечения надлежащей гидратации. Инкубируйте рабочую пластину с картриджем датчика при температуре 37 градусов Цельсия в течение не менее 10 часов в инкубаторе без углекислого газа. Далее наполните 50 миллилитровую коническую трубку 50 миллилитровым раствором калибранта и инкубируйте.
На следующий день переверните тарелку, чтобы удалить дистиллированную воду. Увлажните пластину 200 микролитрами калибра. Установите на место картридж датчика в верхней части рабочей пластины и поместите ее обратно в инкубатор без углекислого газа.
Затем с помощью многоканальной пипетки повторно суспендируйте 10 миллионов CD8 Т-клеток в 4,5 миллилитрах полной среды. Пипеткой подайте 90 микролитров суспензии в каждую лунку, а затем 90 микролитров назначенной среды в лунку во время предварительной обработки. Впрыскивайте пипеткой 180 микролитров готовой среды в угловые лунки для предотвращения испарения.
Затем поместите микропланшет с CD8 Т-клетками в инкубатор без углекислого газа. Надежно закрепите адаптеры пластин на картридже датчика. После инкубации используйте пластинчатые адаптеры для дозирования олигомицина, FCCP, ротенона и антимицина А в соответствующие порты.
Поместите микропланшет в инкубатор без углекислого газа за час до начала анализа. Откройте программное обеспечение и откалибруйте приборный анализатор за 30 минут до загрузки микропланшета. Промаркируйте скважины и ознакомьтесь со схемой закачки в программном комплексе.
Затем загрузите картридж датчика в прибор во время калибровки. Проведите анализ с помощью программного обеспечения. Для дополнительных впрысков измените схемы впрыска с помощью дополнительной камеры для впрыска.
Загрузите анти-CD3 и анти-CD28 в порт А картриджа датчика. Загрузите олигомицин в порт В, FCCP в порт С, а ротенон и антимицин А в порт D. Для индивидуальной стимуляции анти-CD3 и анти-CD28 внесите 20 микролитров биотинилированного анти-CD3 в концентрации 10 микрограммов на миллилитр в специальные лунки сенсорного картриджа. Пипеткой внесите 20 микролитров анти-CD28 и стрептавидина в предназначенные лунки.
Для стимуляции анти-CD3 или CD28 смешайте и пипетируйте 20 микролитров биотинилированных анти-CD3, анти-CD28 и стрептавидина в специальные лунки. Подготовьте контрольные скважины путем закачки закачки. Для комбинированной стимуляции анти-CD3 и CD-28 используйте соотношение шариков к клеткам один к одному и пипетируйте пять микролитров магнитных шариков анти-CD3 CD-28 в специальные лунки, содержащие 200 000 клеток на лунку.
Готовьте контрольные скважины с загрузкой только к закачке. Отрегулируйте содержание ядов в каждом порту для достижения окончательных концентраций после впрыска. Перед загрузкой микропланшета в прибор убедитесь, что схема впрыска отражает обновленные временные точки.
Запрограммируйте программное обеспечение на выполнение анализа острой стимуляции TCR в общей сложности на 140 минут. Измените схему, включив в нее 10 измерений по временным точкам перед инъекцией олигомицина. Острая стимуляция TCR с использованием биотинилированных анти-CD3 и/или анти-CD28 со стрептавидином и стимуляция магнитными шариками анти-CD3 и/или CD-28 приводила к увеличению скорости потребления кислорода и скорости внеклеточного закисления по сравнению с контрольной группой, состоящей только из среды.
Стимуляция магнитными шариками анти-CD3 и CD-28 показала метаболические реакции, сравнимые с биотинилированными инъекциями анти-CD3 и CD-28 с аналогичным увеличением скорости потребления кислорода и скорости внеклеточного закисления.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучается влияние лизофосфатидной кислоты на цитотоксичность Т-клеток CD8 и их метаболическую гибкость. Методология включает тест на митохондриальный стресс (Mito Stress Test) для анализа биоэнергетики Т-клеток и рецепторной сигнализации.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Клеточный метаболизм
- Биология T-клеток
Теоретические сведения
- T-клетки CD8 играют решающую роль в иммунных ответах.
- Лизофосфатидная кислота влияет на функцию и метаболизм T-клеток.
- Понимание метаболического программирования имеет важное значение для иммунной толерантности.
- Биоэнергетический анализ может дать представление о поведении T-клеток.
Цель исследования
- Изучить влияние лизофосфатидной кислоты на метаболизм Т-клеток CD8.
- Оценить взаимосвязь между сигнализацией Т-клеточного рецептора и биоэнергетикой.
- Использовать анализ в режиме реального времени для оценки функционального метаболизма.
Используемые методы
- Тест на митохондриальный стресс для биоэнергетического профилирования.
- Измерение митохондриального метаболизма в Т-клетках CD8.
- Экспериментальные протоколы для оценки метаболической гибкости.
- Анализ сигналинга Т-клеточного рецептора в режиме реального времени.
Основные результаты
- Лизофосфатидная кислота снижает метаболическую гибкость Т-клеток CD8.
- Изменение метаболического статуса влияет на фенотипы Т-клеток.
- Оценка в режиме реального времени позволяет получить представление о биоэнергетике Т-клеток.
- Результаты указывают на потенциальные терапевтические мишени для иммунной модуляции.
Выводы
- Лизофосфатидная кислота является ключевым регулятором метаболизма CD8 T-клеток.
- Понимание метаболических изменений может помочь в разработке стратегий иммунологической толерантности.
- Будущие исследования могут быть направлены на изучение терапевтических возможностей модуляции T-клеток.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Количественная оценка митохондриальной функции в наивных и эффекторных CD8 Т-клетках позволяет снизить механистические риски при выборе иммунометаболических мишеней на ранних этапах поиска. Биоэнергетический профилинг в режиме реального времени обеспечивает прогностическую уверенность в функциональных состояниях Т-клеток, что способствует валидации мишеней и обеспечению трансляционной преемственности. Данный рабочий процесс позиционирует иммунометаболизм как критическую ось для сортировки портфеля проектов и стратегий иммуномодуляции.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать метаболические пути Т-клеток, связанные с иммунной функцией.
- Способствует снижению биологических рисков путем количественной оценки метаболической гибкости в ответ на стимуляцию рецепторов.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней за счет измерения скорости потребления кислорода и закисления в режиме реального времени.
- Обеспечивает прогностическую уверенность при приоритизации иммуннометаболических мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных систем иммунных клеток для последующего скрининга соединений.
- Стандартизация условий анализа для воспроизводимого измерения митохондриальной активности.
- Получение количественных данных, подходящих для сравнительного анализа различных условий.
- Обеспечение возможности масштабируемой адаптации для высокопроизводительного скрининга метаболических модуляторов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет метаболическое фенотипирование с состояниями иммунных клеток, имеющими значение для заболевания.
- Обеспечивает преемственность от этапа поиска до доклинической валидации стратегий иммуномодуляции.
- Позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении на основе функциональных метаболических показателей.
- Обеспечивает понимание механизмов путей иммунной толерантности и иммунного надзора.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод биоэнергетического анализа охватывает весь путь от начального этапа поиска до идентификации ведущих соединений-кандидатов и доклинических исследований иммуномодуляции.
- Открывающая биология: Количественная оценка метаболического ответа T-клеток на стимуляцию рецепторов для выяснения зависимостей путей передачи сигнала.
- Скрининг: Получение воспроизводимых количественных данных о функции митохондрий для подтверждения готовности анализа.
- Аналитика: Определение скорости потребления кислорода и скорости внеклеточного закисления для надежного статистического сравнения.
- Трансляционные исследования: Установление связи между метаболизмом иммунных клеток и функциональными фенотипами, имеющими значение для моделей заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: Предоставление настраиваемой платформы для различных иммунометаболических исследований в рамках различных программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность валидации иммунных мишеней и снижает риски при изучении механизмов действия.
- Операционная ценность: стандартизирует метаболические анализы для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости в разных исследовательских группах.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и снижает биологические риски на поздних стадиях в портфелях иммунных препаратов.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию иммунометаболических мишеней и трансляционных стратегий с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области выделения иммунных клеток и настройки метаболических анализов.
- Необходим доступ к анализаторам и совместимому программному обеспечению для сбора данных в режиме реального времени.
- Требуется межкомандная стандартизация условий анализа и интерпретации данных.
- Метод адаптируема к различным типам иммунных клеток и протоколам стимуляции рецепторов.
- Результаты зависят от надежных процедур контроля и калибровки для обеспечения достоверности данных.
