Обнаружение вируса SARS-CoV-2 с помощью изотермической амплификации, опосредованной петлей обратной транскрипции
8 сентября 2023 г.
Здесь мы предоставляем полный протокол для стандартизации и реализации метода обнаружения вируса SARS-CoV-2 в образцах человека с помощью изотермической амплификации с обратной транскрипцией, опосредованной петлей (RT-LAMP). Этот метод, выполненный в течение 60 минут, может быть адаптирован к любой лаборатории или месту оказания медицинской помощи по низкой цене и с использованием недорогого оборудования.
Наше исследование направлено на стандартизацию LAMP в качестве предварительного диагностического теста, подходящего для полевых или первичных медицинских учреждений, не имеющих развитой лабораторной инфраструктуры. Мы стремимся продвигать использование буферов местного производства и альтернативных красителей, снижая зависимость от импортных коммерческих наборов. В настоящее время CRISPR-Cas является эффективной системой, используемой для разработки быстрых, специфичных и чувствительных методов диагностики патогенов.
Теперь эта система имеет широкий спектр добавок для обнаружения мишеней РНК или ДНК в различных образцах, представляющих интерес. Текущие экспериментальные задачи связаны с предотвращением нецелевой амплификации в результате загрязнения ампликонов и первичных клеток, особенно с длинными праймерами, склонными к образованию димеров. Кроме того, мы стремимся определить оптимальные условия реакции для достижения визуально различимого изменения цвета красителя.
После того, как он стандартизирован и полностью проверен, этот метод может быть легко внедрен и адаптирован к любой лаборатории или месту оказания медицинской помощи в течение 60 минут, с низкими затратами и использованием недорогого оборудования, для обнаружения практически любого патогена. Таким образом, он потенциально может быть использован в центрах первичной медико-санитарной помощи для проведения своевременного эпидемиологического надзора. Наша междисциплинарная группа занимается открытием молекул из местных колумбийских растений, пытаясь определить потенциал ингибирования репликации вирусов, таких как денге, Зика или SARS-COVID-2.
Кроме того, мы проводим исследования по разработке молекулярных методов диагностики этих вирусов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен стандартизированный протокол обнаружения вируса SARS-CoV-2 с помощью обратной транскрипции и петлевой изотермической амплификации (RT-LAMP). Метод разработан для условий с ограниченными ресурсами и позволяет проводить экспресс-диагностику в течение 60 минут с использованием недорогого оборудования.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Диагностика вирусных инфекций
- Внедрение методов LAMP
- Доступные решения в области здравоохранения
Теоретические сведения
- Важность своевременного обнаружения SARS-CoV-2
- Потребность в экономически эффективных средствах диагностики
- Проблемы современных методов молекулярной диагностики
Используемые методы
- Обратная транскрипция и петлевая изотермическая амплификация (RT-LAMP)
- Использование локальных буферов и красителей
- Колориметрическое определение с помощью гидроксинафтолового синего
Основные результаты
- Разработка экспресс-метода диагностики с высокой специфичностью и чувствительностью
- Оптимизация условий реакции для достижения заметного изменения цвета
- Подтверждение применимости метода для использования в учреждениях первичной медико-санитарной помощи
Выводы
- Данный протокол обеспечивает эффективное и недорогое обнаружение патогенов
- Он обладает потенциалом для широкого применения в эпидемиологическом надзоре
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Быстрая и недорогая молекулярная диагностика, такая как RT-LAMP, имеет критическое значение для раннего обнаружения и локализации возникающих вирусных угроз как в централизованных, так и в децентрализованных условиях. Данный протокол обеспечивает возможность масштабируемого и развертываемого в полевых условиях обнаружения SARS-CoV-2 и других патогенов, поддерживая минимизацию рисков в масштабах всего портфеля и своевременный эпидемиологический надзор. Его адаптивность и минимальные требования к инфраструктуре делают его стратегическим активом для биофармацевтических исследований и разработок, а также для систем реагирования в сфере общественного здравоохранения.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет быстро определить наличие вируса в биологических образцах для валидации мишени.
- Способствует снижению механистических рисков путем подтверждения специфичности амплификации нуклеиновых кислот.
- Облегчает функциональную валидацию комбинаций праймеров и красителей для разработки диагностических систем.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированный, воспроизводимый рабочий процесс для анализов по детектированию нуклеиновых кислот.
- Предоставляет количественные и качественные результаты с помощью колориметрического и электрофоретического считывания.
- Обеспечивает возможность масштабирования анализа в условиях ограниченных ресурсов и при высокой пропускной способности.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует стратегиям трансляционных биомаркеров для эпидемиологического надзора за инфекционными заболеваниями.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа поиска до доклинической валидации диагностических реагентов.
- Снижает риск неудачи анализа на поздних стадиях за счет ранней стандартизации и валидации.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный протокол RT-LAMP интегрируется в континуум диагностических разработок: от ранних этапов создания анализа до его трансляционного внедрения в полевых и клинических условиях.
- Биология открытий: Подтверждает наличие целевой нуклеиновой кислоты и специфичность праймеров для проверки гипотез.
- Скрининг: Стандартизирует колориметрические и электрофоретические результаты для надежного сравнения анализов.
- Аналитика: Обеспечивает измеримое изменение цвета и данные гель-электрофореза для оценки условий.
- Трансляционные исследования: Связывает разработку лабораторных анализов с внедрением готовой к использованию в полевых условиях диагностики.
- Корпоративное повторное использование: Предлагает модульную, адаптируемую платформу для обнаружения различных патогенов, помимо SARS-CoV-2.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает неопределенность в рабочих процессах по обнаружению вирусов.
- Операционная ценность: обеспечивает быструю, недорогую и воспроизводимую диагностику при минимальной инфраструктуре.
- Стратегическая ценность: ускоряет принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки диагностических кандидатов и поддерживает масштабируемый эпиднадзор.
- Влияние на портфель: улучшает приоритезацию активов для диагностики и эпиднадзора с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуются навыки разработки праймеров, работы с нуклеиновыми кислотами и интерпретации результатов колориметрического анализа.
- Необходимо базовое оборудование для молекулярно-биологических исследований, такое как амплификаторы или водяные бани, а также устройства для визуализации.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов приготовления реагентов и контроля контаминации.
- Метод может быть адаптирован для различных типов образцов и патогенов путем соответствующего изменения дизайна праймеров.
- Потенциальные ограничения включают риск неспецифической амплификации и необходимость оптимизации красителя, что подтверждается исходными данными.
