Подготовка образцов для криотомографии клеток млекопитающих in situ
December 15th, 2023
Этот метод обеспечивает доступный и гибкий протокол подготовки сеток электронной микроскопии (ЭМ) для клеточной криотомографии in situ и коррелятивной световой и электронной микроскопии (КЛЭМ).
Целью данного исследования является разработка методологии пробоподготовки, которая была бы доступной и надежно воспроизводимой. Таким образом, возможности прямой клеточной криоэлектронной томографии могут быть использованы для ответа на широкий спектр биологических вопросов. Существует множество проблем, связанных с подготовкой сетки.
Ячейки плохо прикрепляются к сеткам, и манипуляции могут привести к повреждению углеродного слоя, что приведет к потере визуализируемых областей сетки. Кроме того, распространенность тонкоклеточных выпячиваний снижается без учета надлежащих условий пробоподготовки. Современные протоколы, как правило, требуют специализированного оборудования для устранения основных узких мест посева, таких как микроузоры и напечатанные на 3D-принтере держатели для прикрепления клеток и манипуляций соответственно.
Этот протокол обеспечивает решениям большую доступность, сохраняя при этом гибкость для использования этих специализированных инструментов для последующих приложений.
Обзор
Этот метод предоставляет доступный и гибкий протокол для подготовки электронно-микроскопических (ЭМ) сеток для in situ клеточной криотомографии и корреляционной световой и электронной микроскопии (КСЭМ). Протокол решают проблемы при подготовке сетки, обеспечивая прикрепление клеток и минимизируя повреждения углеродного слоя.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Электронная микроскопия
Фон
- Прямая клеточная крио-электронная томография является мощным инструментом для биологических исследований.
- Подготовка сетки является критичной для успешного изображения и анализа.
- Существующие методы часто требуют специализированного оборудования, что ограничивает доступность.
- Этот протокол направлен на упрощение процесса, сохраняя гибкость.
Цель исследования
- Разработать воспроизводимый и доступный метод подготовки ЭМ сетки.
- Улучшить работоспособность крио-электронной томографии в биологических исследованиях.
- Решить обычные проблемы прикрепления клеток и целостности сетки.
Используемые методы
- Обработка сеток свечением для повышения адгезии клеток.
- Нанесение фибронектинов быка для продвижения прикрепления клеток.
- Посев клеток и процедуры трансфекции для молекулярных клонов ВИЧ.
- Падение замораживания сеток для изображения крио-электронной томографии.
Основные результаты
- Успешное прикрепление клеток к ЭМ сеткам с минимальным повреждением.
- Наблюдение клеток, производящих ВИЧ, с помощью крио-корреляционной микроскопии.
- Эффективное сохранение целостности сетки в процессе подготовки.
- Демонстрация воспроизводимости протокола в нескольких испытаниях.
Выводы
- Разработанный протокол улучшает доступность при подготовке ЭМ сетки.
- Это позволяет эффективно изучать клеточные процессы с использованием крио-электронной томографии.
- Будущие применения могут использовать этот метод для различных биологических исследований.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Robust sample preparation for in situ cryotomography of mammalian cells is critical for enabling high-resolution structural studies in native cellular contexts. This protocol addresses key bottlenecks in grid handling, cell attachment, and reproducibility, directly impacting the reliability of downstream imaging and integrative analyses. Improved accessibility and standardization in sample preparation enhance predictive confidence and portfolio decision-making in early discovery and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of cellular ultrastructure for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by preserving native cell environments.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of molecular assemblies in situ.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological samples for correlative imaging workflows.
- Standardizes grid preparation to ensure reproducibility and quantitative imaging outputs.
- Improves readiness for high-content screening and integrative microscopy platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant cellular models for translational continuity.
- Enables structural assessment of viral and cellular interactions in preclinical systems.
- Supports risk-adjusted advancement by providing high-fidelity morphological data.
Pipeline & Workflow Integration
This sample preparation protocol integrates at the interface of discovery biology and advanced imaging, supporting workflows from early mechanistic studies to preclinical model validation.
- Discovery Biology: Provides reproducible sample preparation for hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Delivers standardized, high-quality grids for quantitative imaging and assay development.
- Analytics: Enables acquisition of robust structural data for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by maintaining cellular context in imaging outputs.
- Enterprise Reuse: Establishes a flexible, accessible protocol adaptable to diverse cell types and imaging modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in structural target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of sample preparation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing imaging failures.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, grid handling, and microscopy techniques.
- Needs access to glow discharge devices, biosafety cabinets, and plunge-freezing instrumentation.
- Demands cross-team standardization for reproducible grid preparation and imaging quality.
- Adaptable to various adherent mammalian cell types with protocol modifications as needed.
- Grid fragility and manipulation remain practical limitations requiring careful handling.
