Подготовка образцов для криотомографии клеток млекопитающих in situ
15 декабря 2023 г.
Этот метод обеспечивает доступный и гибкий протокол подготовки сеток электронной микроскопии (ЭМ) для клеточной криотомографии in situ и коррелятивной световой и электронной микроскопии (КЛЭМ).
Целью данного исследования является разработка методологии пробоподготовки, которая была бы доступной и надежно воспроизводимой. Таким образом, возможности прямой клеточной криоэлектронной томографии могут быть использованы для ответа на широкий спектр биологических вопросов. Существует множество проблем, связанных с подготовкой сетки.
Ячейки плохо прикрепляются к сеткам, и манипуляции могут привести к повреждению углеродного слоя, что приведет к потере визуализируемых областей сетки. Кроме того, распространенность тонкоклеточных выпячиваний снижается без учета надлежащих условий пробоподготовки. Современные протоколы, как правило, требуют специализированного оборудования для устранения основных узких мест посева, таких как микроузоры и напечатанные на 3D-принтере держатели для прикрепления клеток и манипуляций соответственно.
Этот протокол обеспечивает решениям большую доступность, сохраняя при этом гибкость для использования этих специализированных инструментов для последующих приложений.
Обзор
Данный метод представляет собой доступный и гибкий протокол подготовки сеток для электронной микроскопии (ЭМ) с целью проведения клеточной криотомографии in situ и корреляционной световой и электронной микроскопии (CLEM). В протоколе рассмотрены проблемы подготовки сеток, что позволяет обеспечить прикрепление клеток и минимизировать повреждение углеродного слоя.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Электронная микроскопия
Теоретическое обоснование
- Прямая криоэлектронная томография клеток является мощным инструментом для биологических исследований.
- Подготовка сеток имеет критическое значение для успешной визуализации и анализа.
- Современные методы часто требуют специализированного оборудования, что ограничивает их доступность.
- Данный протокол направлен на упрощение процесса при сохранении его гибкости.
Цель исследования
- Разработать воспроизводимую и доступную методику подготовки сеток для электронной микроскопии.
- Повысить эффективность использования криоэлектронной томографии в биологических исследованиях.
- Решить распространенные проблемы, связанные с адгезией клеток и целостностью сеток.
Используемые методы
- Обработка сеток разрядом тлеющего газа для улучшения адгезии клеток.
- Нанесение бычьего фибронектина для стимуляции прикрепления клеток.
- Процедуры посева клеток и трансфекции молекулярными клонами HIV.
- Плунжерное замораживание сеток для криоэлектронной томографической визуализации.
Основные результаты
- Успешная прикрепление клеток к сеткам для ЭМ с минимальными повреждениями.
- Наблюдение за клетками, продуцирующими ВИЧ, с помощью криокорреляционной микроскопии.
- Эффективное сохранение целостности сеток в процессе подготовки.
- Демонстрация воспроизводимости протокола в нескольких сериях опытов.
Выводы
- Разработанный протокол повышает доступность подготовки сеток для ЭМ.
- Он позволяет эффективно изучать клеточные процессы с помощью криоэлектронной томографии.
- В будущем данный метод может быть использован для решения различных биологических задач.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Надежная подготовка образцов для криотомографии клеток млекопитающих in situ имеет решающее значение для обеспечения структурных исследований с высоким разрешением в нативном клеточном контексте. Данный протокол устраняет основные трудности при работе с сетками, прикреплении клеток и воспроизводимости, что напрямую влияет на достоверность последующей визуализации и интегративного анализа. Повышение доступности и стандартизация подготовки образцов увеличивают прогностическую уверенность и эффективность принятия решений по портфелю в рамках ранних этапов поиска и трансляционных исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает прямую визуализацию ультраструктуры клеток для снижения механистических рисков.
- Поддерживает функциональную валидацию мишеней за счет сохранения естественной клеточной среды.
- Способствует проверке гипотез путем исследования молекулярных ансамблей in situ.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных биологических образцов для рабочих процессов коррелятивной визуализации.
- Стандартизация подготовки сеток для обеспечения воспроизводимости и получения количественных результатов визуализации.
- Повышение степени готовности к высокопроизводительному скринингу и использованию интегративных микроскопических платформ.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет результаты визуализации с соответствующими клеточными моделями заболеваний для обеспечения трансляционной преемственности.
- Обеспечивает структурную оценку вирусных и клеточных взаимодействий в доклинических системах.
- Поддерживает продвижение исследований с учетом рисков за счет предоставления высокоточных морфологических данных.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный протокол подготовки проб объединяет методы поисковой биологии и передовых методов визуализации, обеспечивая поддержку рабочих процессов — от ранних механистических исследований до валидации на доклинических моделях.
- Поисковая биология: обеспечивает воспроизводимую подготовку образцов для проверки гипотез и уточнения путей передачи сигнала.
- Скрининг: предоставляет стандартизированные высококачественные сетки для количественной визуализации и разработки анализов.
- Аналитика: позволяет получать надежные структурные данные для сравнительного анализа при различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: связывают поисковые и доклинические исследования за счет сохранения клеточного контекста в результатах визуализации.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает гибкий и доступный протокол, адаптируемый к различным типам клеток и методам визуализации.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования и снижает неопределенность при валидации структурных мишеней.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость, стандартизацию и масштабируемость рабочих процессов подготовки образцов.
- Стратегическая ценность: улучшает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет сокращения числа неудач при визуализации.
- Влияние на портфель: обеспечивает приоритезацию с учетом рисков и продвижение структурно валидированных мишеней.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с культурами клеток, манипулирования с сетками и методы микроскопии.
- Необходим доступ к устройствам тлеющего разряда, боксам биологической безопасности и оборудованию для plunge-freezing.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости подготовки сеток и качества изображений.
- Метод адаптируем для различных типов адгезивных клеток млекопитающих при необходимости внесения модификаций в протокол.
- Хрупкость сеток и сложности при манипулировании с ними остаются практическими ограничениями, требующими осторожного обращения.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:10
Preparing Electron Microscopy (EM) Grids for Cellular Cryotomography
3:34
Cell Seeding and Transfection on Electron Microscopy (EM) Grids for Cryotomography
5:34
Plunge Freezing of Electron Microscopy (EM) Grids for Cryotomography
