Изучение динамики мышечной транскрипции в одномолекулярных масштабах у дрозофилы
8 сентября 2023 г.
Дрозофила является хорошо зарекомендовавшей себя моделью для изучения ключевых молекул, регулирующих миогенез. Однако существующих методов недостаточно для определения транскрипционной динамики мРНК и пространственного распределения в синцитии. Чтобы устранить это ограничение, мы оптимизировали метод флуоресценции РНК in situ , позволяющий обнаруживать и количественно определять мРНК в масштабе одной молекулы.
В нашей команде мы изучали клеточные и молекулярные механизмы, управляющие развитием и восстановлением мышц. На самом деле, известно, что особое распределение молекул мРНК регулирует различные клеточные процессы. В данном случае мы используем дрозофилу в качестве модели для исследования того, как мРНК распределяются в мышечной ткани мухи.
Доказано, что динамика экспрессии генов регулирует различные мышечные биологические процессы. Появление высокопроизводительных методов секвенирования РНК одной клетки и одного ядра позволило всесторонне исследовать транскрипционную динамику. Одним из заметных ограничений классических омиксных методов является неспособность обеспечить пространственное распределение молекул мРНК в мышечных волокнах дрозофилы.
Эта особенность может быть исследована методом флуоресценции одной молекулы in situ. Современные методы недостаточны для определения транскрипционной динамики мРНК и пространственного распределения в мышечной системе дрозофилы. Чтобы устранить это ограничение, мы оптимизировали метод обнаружения и кодификации отдельных молекул мРНК в мышечных волокнах дрозофилы с высоким пространственным разрешением и масштабами сигнальных молекул.
Актуальной задачей в этой области является визуализация динамики регенерации мышц в режиме реального времени и на живых животных. Вот почему мы пытаемся разработать подход к визуализации в реальном времени, чтобы визуализировать поведение мышечных стволовых клеток в их родной среде, а также решить вопрос об их способе и диапазоне миграции, например, во время регенерации мышц, а также об их дифференцировке, и это с беспрецедентным разрешением.
Обзор
В данном исследовании изучаются клеточные и молекулярные механизмы развития и восстановления мышц у Drosophila. Путем оптимизации метода флуоресцентной гибридизации in situ РНК авторы стремятся визуализировать и количественно оценить распределение мРНК на уровне отдельных молекул в мышечных волокнах.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Биология развития
Теоретическая часть
- Drosophila служит модельным организмом для изучения миогенеза.
- Понимание пространственного распределения мРНК имеет решающее значение для выяснения биологии мышц.
- Современные методы не позволяют визуализировать динамику мРНК в мышечных тканях.
- Одномолекулярная флуоресцентная гибридизация in situ (smFISH) предлагает решение этой проблемы.
Цель исследования
- Оптимизировать методы детектирования и количественного определения мРНК в мышечных волокнах Drosophila.
- Визуализировать динамику регенерации мышц в режиме реального времени.
- Изучить поведение стволовых клеток мышц в их естественной среде.
Используемые методы
- Флуоресцентная гибридизация in situ (smFISH) для детекции мРНК.
- Диссекция и фиксация тканей личинок и взрослых особей Drosophila.
- Конфокальная микроскопия для визуализации распределения мРНК.
- Анализ изображений с помощью ImageJ для количественной оценки точек мРНК.
Основные результаты
- Оптимизированный метод smFISH позволяет осуществлять визуализацию мРНК с высоким разрешением.
- Определены закономерности пространственного распределения мРНК в непрямых летальных мышцах.
- Продемонстрирована колокализация мРНК с белковыми маркерами.
- Получены новые данные о поведении стволовых клеток мышц в процессе регенерации.
Выводы
- Данное исследование углубляет понимание динамики мРНК при развитии мышц.
- Оптимизированные методы могут быть применены к другим тканям и организмам.
- Будущая работа будет сосредоточена на визуализации процессов регенерации мышц в режиме реального времени.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Метод FISH на уровне отдельных молекул РНК в мышцах Drosophila позволяет проводить точный количественный анализ и пространственное картирование транскриптов мРНК, восполняя критический пробел в понимании транскрипционной регуляции в сложных синцитиальных тканях. Эта возможность повышает точность прогнозирования при валидации мишеней и снижении механистических рисков в программах по биологии мышц. Данный подход обеспечивает трансляционную преемственность от этапа ранних открытий до разработки доклинических моделей в рамках терапевтических разработок, связанных с мышечной тканью.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Первичный поиск и валидация мишени
- Обеспечивает возможность прямой визуализации и количественной оценки транскриптов целевого гена с одномолекулярным разрешением в мышечных клетках.
- Поддерживает механизм снижения рисков за счет картирования пространственного распределения мРНК в синцитиальных мышечных волокнах.
- Облегчает функциональную валидацию мишени путем корреляции локализации транскрипта с экспрессией белка в соответствующих типах клеток.
- Повышает прогностическую уверенность при продвижении мишеней, связанных с мышечной тканью, в портфелях разработок.
Скрининг и разработка анализа
- Создает валидированные биологические системы для последующего скрининга модуляторов экспрессии генов.
- Обеспечивает количественные, воспроизводимые результаты для стандартизации и бенчмаркинга анализа.
- Позволяет использовать рабочие процессы высококонтентного имиджинга для оценки соединений в клетках-предшественниках и стволовых клетках мышц.
- Поддерживает масштабируемость и повторное использование платформы для различных генных мишеней и моделей мышц.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует системам, имеющим отношение к заболеванию, путем моделирования транскрипционной динамики в клетках мышц взрослых особей и клетках-предшественниках.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации за счет количественного определения мРНК как в контексте развития, так и в контексте регенерации.
- Поддерживает принятие решений о продвижении с учетом рисков, предоставляя надежные количественные молекулярные конечные точки.
- Способствует идентификации трансляционных биомаркеров с помощью пространственной транскриптомики в мышечных тканях.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Этот метод количественного определения мРНК на уровне отдельных молекул интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, связывая раннюю валидацию мишеней, разработку анализов и трансляционные исследования в области биологии мышц.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей передачи сигнала путем картирования экспрессии генов с субклеточным разрешением.
- Скрининг: обеспечивает количественные, воспроизводимые результаты для оценки готовности анализа и скрининга соединений в мышечных системах.
- Аналитика: предоставляет измерения с высоким разрешением и статистические данные для сравнения экспрессии генов в различных условиях и типах клеток.
- Трансляционные исследования: обеспечивает согласованность с моделями соответствующих заболеваний и способствует поиску биомаркеров регенерации и дифференцировки мышц.
- Корпоративное повторное использование: предлагает многократно используемую платформу для визуализации и количественного анализа, адаптируемую к различным генным мишеням и моделям мышц.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней в мышечной ткани.
- Операционная ценность: Стандартизирует рабочие процессы количественной визуализации и повышает воспроизводимость результатов между различными исследовательскими группами.
- Стратегическая ценность: Обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет предоставления надежных молекулярных конечных точек.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию и продвижение программ разработки терапевтических средств для лечения мышечных заболеваний с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с передовыми методами визуализации, генетикой Drosophila и количественным анализом изображений.
- Необходим доступ к конфокальной микроскопии и вычислительной инфраструктуре для обработки изображений.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов подготовки образцов и анализа.
- Метод может быть адаптирован для других моделей синцитиальных или сложных тканей при оптимизации протокола.
- Ограничено визуализацией фиксированных тканей; методы визуализации живых объектов находятся в стадии разработки.
