Расщепленная сетчатка как усовершенствованный плоский препарат для исследования нейронов внутреннего ядерного слоя сетчатки позвоночных
16 января 2024 г.
В этой работе представлен альтернативный препарат плоской сетчатки, в котором удаление тел фоторецепторных клеток обеспечивает более быструю диффузию антител и улучшенный доступ к внутренним нейронам сетчатки с помощью пипетки для иммуногистохимии, гибридизации in situ и электрофизиологических экспериментов.
Наша группа интересуется нейронными схемами и синаптическими механизмами, лежащими в основе зрительной обработки в сетчатке. Лаборатория Морганса исследует молекулярные механизмы адаптации к свету в биполярных клетках, а лаборатория Сивьера интересуется тем, как внутренние нейроны сетчатки способствуют функционированию ганглиозных клеток. Доступ к нейронам межъядерного слоя во всей сетчатке является сложной задачей как для анатомических, так и для физиологических исследований.
Нейроны межъядерного слоя доступны в вертикальных секциях, но в поле зрения их очень мало. Кроме того, нарезка разрывает боковые отростки и соединения, которые могут повлиять на физиологические исследования. Удаление фоторецепторов в технике расщепления сетчатки значительно улучшает диффузию антител во внутреннюю сетчатку, что делает иммуномечение внутренних мишеней сетчатки более чем в 20 раз быстрее по сравнению с традиционной цельной сетчаткой.
Расщепленная сетчатка также значительно улучшает доступ к нейронам межъядерного слоя во время электрофизиологии патч-зажима. Метод расщепления сетчатки откроет двери для новых подходов и ускорит темп наших экспериментов. Например, мы планируем использовать эту методику для изучения входов биполярных клеток в ганглиозные клетки меланопсина путем экспрессии каналродопсина в биполярных клетках.
Обзор
В данной работе представлен новый метод подготовки сетчатки в виде плоского препарата (flatmount), который улучшает диффузию антител и облегчает доступ к нейронам внутренних слоев сетчатки. Данная методика значительно повышает эффективность экспериментов по иммуногистохимии, гибридизации in situ и электрофизиологии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология сетчатки
- Электрофизиология
Теоретические основы
- Лаборатория Моргана изучает механизмы световой адаптации в биполярных клетках.
- Лаборатория Сивьера специализируется на нейронах внутреннего слоя сетчатки и их роли в функционировании ганглиозных клеток.
- Традиционные методы цельнопрепаратного окрашивания создают определенные трудности при изучении нейронов внутреннего ядерного слоя.
- Удаление фоторецепторов обеспечивает лучший доступ и сокращает время мечения антителами.
Цель исследования
- Разработать метод, обеспечивающий более быстрый доступ к нейронам внутренних слоев сетчатки.
- Повысить эффективность иммуномаркировки и электрофизиологических экспериментов.
- Далее изучить входы биполярных клеток в меланопсиновые ганглиозные клетки.
Используемые методы
- Для подготовки препарата сетчатки в виде плоского mounts-монтажа использовался метод эксплантации сетчатки ex vivo.
- Биологическая модель предполагала выделение сетчатки из глаз мыши для получения доступа к нейронам внутреннего ядерного слоя.
- Для анализа применялись методы иммунофлуоресценции и электрофизиологические методы.
- Критически важные этапы включали аккуратную диссекцию, промывку в PBS и перенос в карбогенизированную среду Эймса.
- Диффузия антител оценивалась после одного часа инкубации.
Основные результаты
- Новая методика позволила увеличить скорость диффузии антител более чем в 20 раз по сравнению с традиционными методами.
- В процессе подготовки была сохранена целостность синапсов фоторецепторов.
- После разделения наблюдалась региональная вариабельность жизнеспособности клеток, при этом большинство клеток сетчатки остались жизнеспособными.
- Результаты иммунофлуоресцентного анализа подтвердили сохранение синаптических терминалей фоторецепторов.
Заключение
- Данный метод облегчает доступ к нейронам внутренних слоев сетчатки для различных экспериментальных подходов.
- Он повышает скорость и эффективность иммуномаркирования и физиологических исследований.
- Полученные результаты могут иметь значение для дальнейшего изучения нейронных механизмов в сетчатке.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Эффективный доступ к нейронам внутреннего ядерного слоя имеет решающее значение для снижения рисков при определении мишеней на ранних стадиях офтальмологических исследований и проверки механистических гипотез при поиске лекарственных средств для терапии заболеваний сетчатки. Метод приготовления раздельного препарата сетчатки (flatmount) ускоряет количественное иммуномаркирование и электрофизиологический анализ, что повышает прогностическую достоверность при изучении нейронных путей. Данная методика оптимизирует отбор перспективных проектов в портфеле и обеспечивает трансляционную преемственность программ по исследованию зрения.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Обеспечивает возможность прямого анализа взаимодействия биполярных и горизонтальных клеток для снижения рисков при изучении механизмов.
- Поддерживает функциональную валидацию мишеней за счет сохранения латеральных нейронных связей.
- Способствует быстрой проверке гипотез о синаптических механизмах, имеющих значение для зрительного восприятия.
Скрининг и разработка анализа
- Предоставляет валидированную биологическую систему для высокопроизводительного иммуномаркирования и анализа методом патч-клампа.
- Повышает воспроизводимость анализа за счет сохранения целостности синапсов и жизнеспособности клеток.
- Обеспечивает количественные результаты для скрининга воздействия соединений на нейроны внутренней сети сетчатки.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям заболеваний для изучения сетей сетчатки, участвующих в нарушениях зрения.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации за счет поддержки множества аналитических модальностей.
- Снижает риск получения артефактных результатов благодаря сохранению физиологических связей в тканевой модели.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данная методика подготовки служит связующим звеном между этапом первичного поиска и доклиническими исследованиями, обеспечивая возможность проведения надежного функционального и молекулярного анализа нейронов внутренней сети сетчатки.
- Открывающая биология: ускоряет проверку гипотез о нейронных путях и синаптических механизмах.
- Скрининг: обеспечивает быстрое и воспроизводимое иммуномаркирование и электрофизиологический анализ.
- Аналитика: предоставляет количественные измерения диффузии антител и жизнеспособности клеток для сравнительных исследований.
- Трансляционные исследования: поддерживает сохранность нейронных цепей, имеющих значение при заболеваниях, для изучения биомаркеров и механизмов патологии.
- Корпоративное использование: представляет собой многократно используемую платформу для различных исследований сетчатки и приложений для скрининга.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней в сетчатке.
- Операционная ценность: Стандартизирует подготовку для обеспечения воспроизводимых и масштабируемых рабочих процессов между различными исследовательскими группами.
- Стратегическая ценность: Позволяет быстрее принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) и эффективно использовать капитал для продвижения активов в области исследований зрения.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию мишеней и модальностей для сетчатки с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Для достижения оптимальных результатов требуется опыт в области диссекции сетчатки и работы с тканями.
- Необходим доступ к оборудованию для электрофизиологических и иммунофлуоресцентных исследований.
- Для обеспечения воспроизводимости в многоцентровых исследованиях требуется стандартизация между исследовательскими группами.
- Может потребоваться адаптация метода для различных видов животных или моделей заболеваний.
- При внедрении метода следует контролировать региональную вариабельность жизнеспособности клеток.
