Отслеживание высвобождения микроРНК во внеклеточные везикулы с помощью проточной цитометрии
6 октября 2023 г.
Здесь мы описываем простой протокол, который позволяет in vitro оценить обилие флуоресцентно меченных микроРНК для изучения динамики упаковки микроРНК и экспорта во внеклеточные везикулы (ВВ).
Моя лаборатория занимается изучением микроРНК, и мы уже несколько десятилетий знаем, что микроРНК истощаются при раке. Тем не менее, механизм того, как эти микроРНК теряются, активно не изучен. Наша недавняя работа над внеклеточными везикулами предполагает, что микроРНК, которые истощены при раке, активно загружаются в эти внеклеточные везикулы.
Наша цель сейчас состоит в том, чтобы действительно добраться до механизма того, как эти РНК активно загружаются во внеклеточные везикулы в процессе опухолевого генеза. Протокол помогает понять и зафиксировать динамический процесс высвобождения микроРНК во внеклеточные везикулы, что является одной из сложных областей в изучении биологии внеклеточных везикул. Наши результаты предоставляют инструмент для продвижения в изучении путей, которые регулируют истощение микроРНК при раке.
Мы планируем выявить функциональные и фенотипические последствия потери определенных субпопуляций микроРНК через внеклеточные везикулы при раке. После того, как мы определили факторы, которые участвуют в загрузке этих микроРНК во внеклеточные везикулы, наша цель состоит в том, чтобы понизить регуляцию этих факторов и оценить фенотипические последствия. Более того, поскольку мы идентифицировали мотив, содержащийся в этих малых РНК, нам любопытно узнать, является ли этот мотив необходимым и достаточным для загрузки этих РНК во внеклеточные везикулы.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Данное исследование посвящено изучению динамики упаковки и экспорта микроРНК во внеклеточные везикулы (EV) в контексте онкологических заболеваний. Используя простой протокол для анализа in vitro, авторы стремятся выяснить, каким образом микроРНК, уровень которых в раковых клетках обычно снижен, активно загружаются в EV, что позволяет глубже понять механизмы туморогенеза.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Биология микроРНК
- Динамика внеклеточных везикул
- Исследования рака
Теоретическая часть
- Признано, что в различных типах рака наблюдается дефицит микроРНК.
- Механизмы потери микроРНК при раке изучены недостаточно.
- Внеклеточные везикулы могут играть критическую роль в дисрегуляции уровней микроРНК.
Используемые методы
- Проточная цитометрия для анализа флуоресцентно меченных микроРНК в клетках и внеклеточных везикулах (EV).
- Клетки Calu-6 как модельная система для изучения динамики микроРНК.
- Выделение внеклеточных везикул (EV) и их последующий анализ с помощью нано-проточной цитометрии.
Основные результаты
- Валидирован протокол захвата динамического высвобождения микроРНК в EV.
- Продемонстрировано времязависимое накопление специфических микроРНК в EV.
- Наблюдалось дифференциальное удержание микроРНК клеточного происхождения по сравнению с микроРНК, происходящими из EV.
Выводы
- В исследовании эффективно описаны механизмы, лежащие в основе загрузки микроРНК в внеклеточные везикулы.
- Работа закладывает основу для дальнейшего изучения истощения запасов микроРНК при раке и вытекающих из этого последствий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Количественное отслеживание экспорта miRNA во внеклеточные везикулы (EV) устраняет критический пробел в понимании межклеточной коммуникации и истощения запасов miRNA в системах, релевантных для изучения заболеваний. Данный протокол позволяет снизить механистические риски на этапе валидации мишени, уточняя динамику и специфичность загрузки miRNA в EV. Такие данные повышают прогностическую точность на ранних этапах поиска и в рамках трансляционных исследований.
Стратегические применения в исследованиях и разработках биофармацевтики
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать механизмы экспорта miRNA, имеющие значение для биологии заболеваний.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем установления связи между истощением miRNA и путями, опосредованными внеклеточными везикулами (EV).
- Способствует механистическому снижению рисков при проверке терапевтических гипотез на основе miRNA.
- Предоставляет количественные данные для приоритизации мишеней miRNA в онкологических портфелях.
Скрининг и разработка анализа
- Разработка валидированных методов проточной цитометрии для отслеживания динамики miRNA в живых клетках и внеклеточных везикулах (EV).
- Обеспечение воспроизводимости и стандартизации анализа с помощью количественного считывания флуоресценции.
- Возможность масштабируемого скрининга факторов, влияющих на загрузку miRNA в EV.
- Подготовка надежных биологических систем для последующей оценки соединений, воздействующих на пути формирования EV.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям, релевантным для заболевания, за счет использования линий раковых клеток для изучения экспорта miRNA.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации взаимодействий между miRNA и EV.
- Способствует идентификации трансляционных биомаркеров, связанных с истощением miRNA, опосредованным EV.
- Снижает риски при принятии решений о дальнейшем продвижении исследования путем выяснения функциональных последствий экспорта miRNA.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол интегрируется в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, обеспечивая количественный анализ экспорта miRNA, что способствует как проверке гипотез, так и последующему скринингу.
- Фундаментальная биология: разъясняет механизмы потери и экспорта miRNA через EV, что помогает при выборе мишеней.
- Скрининг: предоставляет стандартизированные воспроизводимые методы анализа для оценки факторов загрузки miRNA.
- Аналитика: обеспечивает количественные данные флуоресценции и qRT-PCR для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: связывает механистические выводы с моделями заболеваний, значимыми для разработки биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: предлагает универсальную платформу для изучения различных взаимодействий miRNA-EV в рамках разных проектов.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования при валидации мишеней miRNA и углубляет понимание механизмов.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость анализов EV-miRNA.
- Стратегическая ценность: служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и снижает биологические риски на поздних этапах в программах, ориентированных на miRNA.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию мишеней miRNA и путей EV с учетом рисков.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт работы с методами проточной цитометрии, qRT-PCR и выделения внеклеточных везикул (EV).
- Необходим доступ к откалиброванным проточным цитометрам и платформам для нано-проточной цитометрии.
- Требуется строгая стандартизация стратегий гейтирования и контролей компенсации между исследовательскими группами.
- Может потребоваться адаптация методики для различных типов клеток или субпопуляций EV.
- Чувствительность приборов и качество подготовки образцов напрямую влияют на достоверность данных.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:32
Flow Cytometry Analysis of Cell‐miRNA and EV‐miRNA Signal in Calu6 Cells Transfected with Fluorophore‐Conjugated EV‐miRNA
4:28
Flow Cytometry Analysis of Cell‐miRNA and EV‐miRNA Signal in EVs Isolated from Calu6 Cells Transfected with Fluorophore‐Conjugated EV‐miRNA
