Интратекальная инъекция новорожденной мыши для редактирования генома и доставки лекарств
8 марта 2024 г.
В настоящем протоколе изложены пошаговые инструкции по выполнению интратекальных инъекций новорожденным мышам для редактирования генов и доставки лекарств.
Наша группа использует междисциплинарный подход, включающий геномные открытия и функциональное моделирование для изучения генетики и эпигенетических основ нарушений развития нервной системы. Мы проводим молекулярный, нейрофизиологический и нейроповеденческий анализ с использованием индуцированных пациентом плюрипотентных стволовых клеток, или ИПСК, у мутантных мышей, чтобы препарировать патофизиологию нарушений развития нервной системы. Мы стремимся разработать метод лечения этого заболевания, основанный на редактировании генов.
Интрацеребровентрикулярная инъекция, также называемая ICV, является единственным методом непосредственной доставки лечения в центральную нервную систему новорожденных мышей. Однако он должен проникать через кору головного мозга. Интратекальная инъекция является широко используемой процедурой в клиниках, служащей эффективным средством для введения лечения непосредственно в центральную нервную систему.
Тем не менее, интратекальная инъекция новорожденным щенкам может представлять значительные технические трудности из-за их небольшого размера и хрупкой природы. Мы пытаемся разработать эффективный и надежный метод доставки для проверки эффективности и редактирования генов в мозге мыши, который не является вирусным и не содержит наночастиц. По сравнению с обычной инъекцией ICV, интратекальная инъекция представляет значительно меньший риск, так как она позволяет избежать необходимости прямого проникновения через кору головного мозга.
Это дает дополнительное преимущество, сводя к минимуму потенциальное повреждение регионарной корковой ткани и окружающих нервов. Интратекальные инъекции также позволяют, по крайней мере, в пять раз увеличить объем вводимых лекарств за одну инъекцию и значительно повышают возможность повторного введения.
Обзор
В данной работе представлен подробный протокол выполнения интратекальных инъекций новорожденным мышам, что позволяет осуществлять редактирование генов и доставку лекарственных препаратов непосредственно в центральную нервную систему. Методика направлена на преодоление трудностей, связанных с хрупкостью новорожденных мышат, и на повышение надежности лечения без повреждения окружающих тканей.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Редактирование генов
- Биология развития
Теоретическая часть
- Целевое редактирование генов может быть эффективно при лечении нарушений нейропсихического развития.
- Интратекальные инъекции представляют собой менее инвазивную альтернативу интрацеребровентрикулярным методам.
- Данная процедура особенно подходит для новорожденных мышей ввиду их малого размера и хрупкости.
- Эффективные методы доставки имеют решающее значение для проверки эффективности редактирования генов на животных моделях.
Цель исследования
- Разработать надежный протокол для введения препаратов непосредственно в центральную нервную систему.
- Повысить безопасность и эффективность методов редактирования генов на мышиных моделях нарушений нейропсихического развития.
- Изучить распределение и эффекты введенных веществ после проведения процедуры.
Используемые методы
- Методика интратекального введения с использованием новорожденных мышей в качестве биологической модели.
- Для прямого введения в спинномозговую жидкость исследовались такие вещества, как лекарственные препараты и препараты CRISPR-Cas9.
- Точность имеет решающее значение: используются шприцы определенного объема, при этом требуется тщательная анатомическая идентификация.
- Особое внимание уделяется послеинъекционному уходу и процессам восстановления детенышей.
Основные результаты
- После инъекции было подтверждено успешное введение и распределение растворов в мозге новорожденных мышей.
- После интратекального введения наблюдалась повсеместная экспрессия репортера YFP в ответ на редактирование генов.
- Метод продемонстрировал значительно большее количество вводимых объемов по сравнению с традиционными методами.
- Снижение риска повреждения тканей коры повышает точность доставки генов.
Выводы
- В данном исследовании продемонстрирован инновационный и эффективный метод доставки лекарственных препаратов и редактирования генов на моделях новорожденных.
- Этот подход позволяет проводить более безопасные вмешательства при изучении нарушений нейропсихического развития.
- Работа подчеркивает важность точного анатомического таргетирования для повышения эффективности терапии заболеваний центральной нервной системы.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Прямое интратекальное введение у новорожденных мышей обеспечивает точную доставку инструментов редактирования генов и терапевтических средств в центральную нервную систему, устраняя критический барьер в разработке нейрогенетических препаратов. Данный протокол снижает риск нецелевого воздействия и повреждения тканей, что повышает прогностическую достоверность при оценке эффективности и безопасности на ранних стадиях. Стандартизация этого метода улучшает трансляционную преемственность при переходе от доклинических моделей к потенциальному клиническому применению при нарушениях нейропсихического развития.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Обеспечивает возможность функционального анализа нейрогенетических мишеней in vivo с минимальным повреждением коры головного мозга.
- Способствует снижению биологических рисков за счет возможности прямой доставки реагентов для редактирования генов и потенциальных терапевтических средств в ЦНС.
- Облегчает надежную оценку взаимодействия с мишенью и механистических результатов на неонатальных моделях.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает воспроизводимую систему для оценки соединений и методов генной терапии, нацеленных на ЦНС, в контролируемых условиях.
- Повышает стандартизацию анализа за счет минимизации процедурной вариабельности и максимального обеспечения стабильности доставки.
- Позволяет проводить количественное измерение распределения и экспрессии после введения в ЦНС.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит доклинические методы доставки в соответствие со стратегиями клинического интратекального введения при нейрогенетических заболеваниях.
- Обосновывает решения о переходе к следующим этапам разработки с учетом рисков, предоставляя надежные данные по экспозиции в ЦНС на моделях новорожденных.
- Облегчает оценку трансляционных биомаркеров и долгосрочных результатов экспрессии генов.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный протокол интегрирован в континуум от поиска до доклинических исследований терапии, направленной на ЦНС, связывая ранние механистические исследования и трансляционные исследования.
- Поисковая биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей передачи сигналов для мишеней нейроразвития посредством прямого воздействия на ЦНС.
- Скрининг: предоставляет валидированную платформу для воспроизводимой оценки соединений и генной терапии в тканях ЦНС новорожденных.
- Аналитика: позволяет проводить количественную оценку распределения в ЦНС, экспрессии генов и фенотипических результатов после инъекции.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность между доклиническими исследованиями эффективности и клиническими методами доставки.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает стандартизированный масштабируемый протокол для многократного применения в различных программах нейрогенетических исследований.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность при разработке терапевтических средств, направленных на ЦНС, и валидации мишеней.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость, стандартизацию и масштабируемость рабочих процессов по доставке препаратов в ЦНС новорожденных.
- Стратегическая ценность: улучшает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и снижает биологические риски на поздних стадиях для нейрогенетических портфелей.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию активов, направленных на ЦНС, с учетом рисков на основе надежных доклинических данных.
Особенности реализации
- Требуется технический опыт работы с новорожденными животными и точное определение анатомических мишеней.
- Необходимо специализированное оборудование для микроинъекций и визуализационный контроль для обеспечения точности введения.
- Требуется строгое соблюдение протоколов благополучия животных и стандартизации процедур.
- Может потребоваться адаптация метода для различных линий грызунов или более крупных моделей животных с учетом анатомических различий.
- Необходимо тщательно контролировать объем и скорость введения препарата во избежание побочных эффектов.
