Выделение, культивирование и характеристика стволовых клеток пульпы зуба из молочных и постоянных зубов человека
17 мая 2024 г.
В этом протоколе особое внимание уделяется извлечению, культивированию и сохранению мультипотентных стволовых клеток из пульпы зуба с помощью ферментативного пищеварения. Кроме того, это демонстрирует их способность дифференцироваться в остеобласты, адипоциты и хондроциты, подчеркивая важность точности и последовательности в процессе.
Начните с фиксации удаленного зуба на месте с помощью зубных щипцов. Затем вырежьте зуб с помощью алмазного диска, соединенного со стоматологическим наконечником и водяной охлаждающей жидкостью. С помощью стоматологического экскаватора удалите ткань пульпы зуба.
Далее с помощью стерильного хирургического лезвия аккуратно измельчите ткань пульпы на мелкие фрагменты. Затем поместите эти фрагменты в мини-измельчитель для тканей с PBS, чтобы образовалась однородная смесь. Переложите фрагменты измельченной ткани в пробирку объемом 15 миллилитров и переварите их с помощью смеси коллагеназы первого типа и диспарируйте.
Инкубируйте ткань в ферментной смеси при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов. После инкубации нейтрализуйте ферменты. Затем переложите переваренную ткань в 15-миллилитровую пробирку и крутите при 300 G в течение пяти минут при комнатной температуре.
Затем осторожно выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в свежем DMEM, дополненном 10-20% FBS. Для культивирования клеток осторожно переложите клеточную суспензию в культуральную колбу площадью 25 квадратных сантиметров. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе.
Через два-три дня с помощью стерильной серологической пипетки осторожно отсадите среду и замените ее свежей средой. Затем для характеристики DPSC включите проточный цитометр и подтвердите природу мезенхимальных стволовых клеток выделенных клеток. Успешная дифференцировка DPSC в остеобласты, адипоциты и хондроциты подтверждает мультипотентную природу DPSC.
Время удвоения DPSC соответствовало таковому, о котором сообщалось для мезенхимальных стволовых клеток, что свидетельствует о здоровой и пролиферативной популяции клеток. Анализ проточной цитометрии показал, что большинство DPSC были положительными на CD-90, CD-73 и CD-105, подтверждая их идентичность как мезенхимальных стволовых клеток. Более того, менее 2% клеток были положительными на CD-34, CD-45 и HLADR, что подтверждает отсутствие значительной контаминации гемопоэтических или эндотелиальных клеток.
Обзор
В данном протоколе особое внимание уделяется выделению, культивированию и сохранению мультипотентных стволовых клеток зубной пульпы с помощью ферментативного переваривания. В работе демонстрируется их способность дифференцироваться в остеобласты, адипоциты и хондроциты.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология стволовых клеток
- Исследования пульпы зуба
- Тканевая инженерия
Теоретические основы
- Мультипотентные стволовые клетки обладают значительным потенциалом в регенеративной медицине.
- Зубная пульпа является богатым источником стволовых клеток.
- Ферментативное переваривание — распространенный метод выделения этих клеток.
- Понимание потенциала дифференцировки имеет решающее значение для терапевтического применения.
Цель исследования
- Выделение и культивирование мультипотентных стволовых клеток из пульпы зуба.
- Оценка дифференцировочного потенциала этих стволовых клеток.
- Разработка надежного протокола выделения и сохранения стволовых клеток.
Используемые методы
- Фиксация извлеченного человеческого зуба с помощью стоматологического пинцета.
- Распиливание зуба с использованием алмазного диска и стоматологической наконечника.
- Удаление тканей пульпы с помощью стоматологического экскаватора.
- Переваривание измельченных тканей пульпы с использованием коллагеназы 1-го типа и диспазы.
Основные результаты
- Успешное выделение мультипотентных стволовых клеток из пульпы зуба.
- Клетки продемонстрировали способность дифференцироваться в остеобласты, адипоциты и хондроциты.
- Протокол обеспечивает точность и воспроизводимость культивирования стволовых клеток.
- Описаны потенциальные возможности применения в регенеративной медицине.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод экстракции стволовых клеток.
- Мультипотентные стволовые клетки пульпы зуба обладают значительным дифференцировочным потенциалом.
- Дальнейшие исследования могут быть направлены на изучение терапевтического применения в тканевой инженерии.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Надежное выделение и характеристика стволовых клеток зубного пульпы (DPSCs) позволяют биофармацевтическим группам получить доступ к стабильному источнику мультипотентных клеток для ранних этапов исследований в области регенеративной медицины. Стандартизированные протоколы экстракции и валидации DPSCs снижают биологическую неоднородность и повышают прогностическую достоверность последующих тестов на дифференцировку и функциональные анализы. Данная возможность укрепляет трансляционный потенциал за счет предоставления воспроизводимых, хорошо охарактеризованных клеточных моделей для проверки терапевтических гипотез и доклинической оценки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет исследовать пути дифференцировки стволовых клеток, имеющие значение для целей регенеративной медицины.
- Способствует снижению биологических рисков путем подтверждения идентичности мезенхимальных стволовых клеток с помощью проточной цитометрии.
- Повышает прогностическую достоверность мультипотентности посредством валидированной трилинейной дифференцировки.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированный источник DPSCs для разработки анализов и скрининга соединений.
- Гарантирует воспроизводимость за счет количественного анализа маркеров и контролируемых условий культивирования.
- Предоставляет валидированные популяции клеток для масштабируемых, готовых к использованию на платформах рабочих процессов скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует регенеративным моделям заболеваний, позволяя осуществлять дифференцировку в остеобласты, адипоциты и хондроциты.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа поиска до доклинической валидации благодаря использованию хорошо охарактеризованных популяций стволовых клеток.
- Снижает трансляционный риск за счет подтверждения отсутствия гемопоэтического или эндотелиального загрязнения.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол рассматривает выделение и характеристику DPSC как связующее звено между этапами первичного поиска и разработки доклинических моделей, что способствует как валидации мишеней, так и трансляционным исследованиям.
- Фундаментальная биология: подтверждает идентичность и мультипотентность стволовых клеток, обеспечивая поддержку гипотез в исследованиях по регенеративной медицине.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые, подтвержденные по маркерам DPSCs для стандартизации анализов и оценки соединений.
- Аналитика: использует проточную цитометрию и колориметрическое окрашивание для количественной оценки идентичности и дифференцировки клеток.
- Трансляционные исследования: позволяет получать типы клеток, имеющие отношение к конкретным заболеваниям, для доклинических исследований.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает воспроизводимый протокол для согласованного получения DPSCs в различных проектах и группах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозов и снижает механистическую неопределенность в исследованиях в области регенерации.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированное, воспроизводимое и масштабируемое выделение и валидацию DPSC.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшего развития проектов (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет обеспечения высокого качества клеточного материала.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков и продвижению программ регенеративной медицины.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с тканями, ферментативным перевариванием и методами культивирования клеток.
- Необходим доступ к оборудованию для проточной цитометрии и колориметрического окрашивания для характеристики клеток.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов выделения и валидации для обеспечения воспроизводимости.
- Может потребоваться адаптация метода в зависимости от источника зубов или вариабельности доноров.
- Выход и чистота клеток зависят от точности проведения ферментативного переваривания и анализа маркеров.
