Применение окрашивания живых митохондрий при сортировке клеток для очистки гепатоцитов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека
1 декабря 2023 г.
Гепатоциты, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, могут быть очищены путем сортировки клеток с использованием комбинации окрашивания митохондриальными и активированными молекулами адгезии лейкоцитарных клеток (ALCAM, также известными как CD166).
Целью наших исследований является очистка индуцированных человеком плюрипотентных гепатоцитов, полученных из стволовых клеток, с использованием без генетической модификации. Мы стремимся решить проблему опухолевого риска, связанного с недифференцированными клетками среди тех, которые дифференцированы от человеческих iPS-клеток. Одной из текущих экспериментальных проблем является низкая чистота клеток, обусловленная механическим хранением сортировки.
Мы разрабатываем новый метод очистки, который использует уникальные особенности метаболизма гепатоцитов для крупномасштабной очистки. Один неклеточный метод сортировки клеток печени-предшественников не может получить чистые гепатоциты. Другой метод для зрелых гепатоцитов может лечить только небольшую часть гепатоцитов из-за ограниченной экспрессии белка-маркера.
В отличие от этого, наш подход позволяет получить гепатоциты на разных уровнях созревания с более высоким порогом. Гепатоциты человека, полученные из iPS-клеток, крайне незрелы и демонстрируют более сниженную макроэкспрессию гепатоцитов после очистки. Наша будущая цель состоит в том, чтобы улучшить модуляцию гепатоцитов с помощью органоидных технологий и повседневных достижений в области регенеративной медицины и разработки лекарств.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Данное исследование посвящено очистке гепатоцитов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, с использованием нового метода сортировки клеток, позволяющего избежать генетических модификаций. В работе особое внимание уделяется решению таких проблем, как низкая жизнеспособность клеток в процессе сортировки, с целью получения более высокого выхода зрелых гепатоцитов для применения в регенеративной медицине и разработке лекарственных препаратов.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Биология стволовых клеток
- Дифференцировка клеток печени
- Технологии сортировки клеток
Теоретические основы
- Плюрипотентные стволовые клетки обладают потенциалом для применения в регенеративной медицине.
- Остаточные недифференцированные клетки представляют риск развития опухолей.
- Современным методам не хватает эффективности для получения чистых популяций гепатоцитов.
Используемые методы
- Флуоресцентная сортировка клеток (FACS)
- Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека
- Методы оценки жизнеспособности и окрашивания клеток
Основные результаты
- Данный метод позволил успешно получить зрелые гепатоциты с высокой степенью чистоты (97%).
- Жизнеспособность клеток была повышена, что позволило решить проблему механического стресса, связанного с сортировкой.
- Чистые популяции гепатоцитоподобных клеток демонстрировали характерную морфологию.
Выводы
- Данное исследование демонстрирует эффективность нового метода сортировки для получения чистых популяций гепатоцитов из стволовых клеток.
- Результаты имеют значение для совершенствования стратегий регенеративной медицины и разработки новых лекарственных препаратов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Очистка гепатоцитов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) человека, является критически важным этапом как для регенеративной медицины, так и для доклинических исследований лекарственных средств, поскольку остаточные недифференцированные клетки создают риск возникновения опухолей. Описываемый рабочий процесс на основе FACS использует окрашивание митохондрий и селекцию по поверхностному маркеру ALCAM для получения высокочистых популяций гепатоцитов без генетической модификации. Это обеспечивает безопасность последующего применения и повышает прогностическую достоверность при моделировании заболеваний и оценке соединений.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Обеспечивает функциональную валидацию дифференцировки гепатоцитов из плюрипотентных стволовых клеток.
- Снижает биологическую неопределенность за счет изоляции популяций зрелых гепатоцитов для изучения механизмов.
- Повышает достоверность прогнозов при анализе взаимодействия с мишенями и изучении сигнальных путей с использованием очищенных клеток.
Скрининг и разработка методов анализа
- Обеспечивает получение стандартизированных популяций гепатоцитов высокой чистоты для воспроизводимой разработки анализов.
- Облегчает количественную оценку специфических маркеров гепатоцитов, таких как экспрессия альбумина.
- Позволяет проводить надежный скрининг соединений за счет минимизации загрязнения недифференцированными клетками или клетками, не являющимися гепатоцитами.
Трансляционные и доклинические исследования
- Улучшает моделирование релевантных заболеваний за счет предоставления функционально валидированных гепатоцитов для исследований токсичности и метаболизма.
- Способствует согласованию трансляционных биомаркеров благодаря стабильному фенотипу клеток и экспрессии маркеров.
- Снижает риски на этапе доклинических исследований, обеспечивая чистоту клеточной популяции и функциональную зрелость.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод очистки на основе FACS интегрируется в непрерывный процесс исследований: от дифференцировки стволовых клеток до идентификации перспективных соединений и доклинической валидации.
- Поисковая биология: обеспечивает проверку гипотез и снижение биологических рисков путем выделения зрелых гепатоцитов из гетерогенных культур.
- Скрининг: позволяет получать воспроизводимые популяции клеток, готовые к проведению анализов для последующей оценки соединений.
- Аналитика: обеспечивает количественное измерение альбумина и других маркеров гепатоцитов для сравнения условий дифференцировки.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность доклинических исследований, требующих валидированных гепатоцитов человека.
- Корпоративное повторное использование: создает масштабируемый негенетический рабочий процесс, адаптируемый к другим линиям клеток, полученных из стволовых клеток.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования и снижает неопределенность механизмов в исследованиях на основе гепатоцитов.
- Операционная ценность: Стандартизирует очистку, повышает воспроизводимость и обеспечивает масштабируемость для более крупных исследований.
- Стратегическая ценность: Улучшает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и снижает биологические риски на поздних этапах в пайплайнах регенеративной медицины и поиска новых лекарств.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию с учетом рисков за счет предоставления высокочистых, функционально валидированных популяций клеток.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами стволовых клеток, эксплуатацией систем FACS и анализом иммуноокрашивания.
- Необходим доступ к современному оборудованию для сортировки клеток и аналитической инфраструктуре.
- Требуется межкомандная стандартизация стратегий гейтирования и валидация маркеров.
- Может потребоваться адаптация для различных линий иПСК или протоколов дифференцировки.
- Жизнеспособность клеток может снизиться из-за механического стресса во время сортировки, что требует оптимизации.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:34
Hepatic Differentiation of Human‐Induced Pluripotent Stem Cells in 2D Cultures
3:52
Cell Preparation for Purification of Human‐Induced Pluripotent Stem Cells‐Derived Hepatocytes
6:44
Fluorescence&‐Activated Cell Sorting of Hepatocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells
