Разработка мультиплексных ОТ-кПЦР-анализов в режиме реального времени для выявления SARS-CoV-2, гриппа A/B и БВРС-КоВ
10 ноября 2023 г.
Мы представляем два собственных одноэтапных набора для ОТ-кПЦР на основе зондов для распространенных респираторных вирусов. Первый анализ проводится на SARS-CoV-2 (N), грипп A (H1N1 и H3N2) и грипп B. Второй — для SARS-Cov-2 (N) и MERS (UpE и ORF1a). Эти анализы могут быть успешно реализованы в любой специализированной лаборатории.
Общая цель этого анализа заключается в применении мультиплексного подхода для одновременного обнаружения широко циркулирующих респираторных вирусов, таких как SARS-CoV-2, MERS, грипп А и грипп B. Преобладающие технологии, способствующие прогрессу в нашей области, включают CRISPR, аминоанализы латерального потока, биомолекулярные сенсоры на бумажной основе, тестирование Шерлока в одном горшке, ДНК-аптамеры и мультиплексную ОТ-кПЦР, интегрированную с петлевой изотермической амплификацией. ЛАМПА. Тем не менее, мультиплексная ОТ-кПЦР является наиболее чувствительной, распространенной и является золотым стандартом для диагностики различных вирусов. В настоящее время экспериментальная задача состоит в том, чтобы создать протокол, который можно было бы использовать для обнаружения копий РНК в количестве всего 10 копий.
Для проведения анализа мы использовали собственный набор RT-qPCR, который является эффективным по времени и с минимальными затратами. Для начала приготовьте 2-кратный буфер для ОТ-кПЦР в воде без ДНК/РНК Храните буфер при температуре минус 20 градусов Цельсия до дальнейшего использования. Далее смешайте праймеры и щупы в тубе объемом 1,5 миллилитров.
Пополните объем элюирующим буфером, затем храните тюбик при температуре минус 20 градусов Цельсия. Приготовьте ферментную смесь с taq-полимеразой и MMLV-RT в тубе объемом 1,5 миллилитра на льду. Восполните объем с помощью буфера для хранения taq-полимеразы.
Теперь ресуспендируйте вирусные синтетические РНК в отдельных пробирках со 100 микролитрами буфера Tris-EDTA, чтобы получить запасы от 10 до шестой копии РНК на микролитр. Чтобы смешать вирусные запасы, добавьте по пять микролитров SARS-CoV-2, гриппа А и В к 50 микролитрам буфера Tris-EDTA. Аналогичным образом смешайте SARS-CoV-2 и MERS-CoV, чтобы получить вторую вирусную смесь.
Разведите обе смеси в десять раз, чтобы получить итоговое разведение 10 копий РНК на микролитр. В каждую лунку 96-луночного планшета пипетка 2x буфера, праймера, фермента, воды без ДНК/РНК и соответствующих смесей РНК. Запечатайте пластину клейкой пломбой.
Затем центрифугируйте пластину в течение одной минуты, чтобы собрать жидкость на дне скважины. Затем запрограммируйте ПЦР-машину на прием быстрого 96-луночного блочного типа с экспериментальным типом, установленным на стандартную кривую. Установите реагенты на реагенты TaqMan и выберите стандартные свойства прогона.
Определите гены-мишени и репортерный краситель. Затем определите имена образцов для каждой тестируемой реакции и назначьте цели и образцы на схеме расположения планшетов. Теперь введите программу цикла в прибор.
Перенесите пластину на станок QPCR в режиме реального времени в правильной ориентации и нажмите кнопку запуска, чтобы запустить цикл. Выберите расположение файла для сохранения экспериментальных данных. Затем изучите графики амплификации, предоставленные программой QPCR.
Два разработанных набора смогли успешно амплифицировать все три гена-мишени одновременно, с 10 копиями РНК за реакцию. Эффективность амплификации для всех вирусных титрований была выше 99%
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен процесс разработки двух наборов для одноэтапной ОТ-кПЦР на основе зондов, предназначенных для одновременного обнаружения распространенных респираторных вирусов, включая SARS-CoV-2, MERS и различные штаммы гриппа. Эти наборы расширяют диагностические возможности специализированных лабораторий благодаря экономичному и быстрому подходу.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Детекция респираторных вирусов
- Метод RT-qPCR
- Разработка мультиплексного анализа
Теоретические основы
- Необходимость быстрой и чувствительной диагностики респираторных вирусов.
- Ограничения современных технологий детекции.
- Важность мультиплексного подхода для одновременного обнаружения.
Используемые методы
- Наборы для ОТ-ПЦР собственной разработки
- Детекция вирусной РНК
- Мультиплексная ОТ-ПЦР в сочетании со специфическими зондами
Основные результаты
- Успешное обнаружение SARS-CoV-2 и MERS наряду с гриппом A и B.
- Достигнута амплификация при концентрации РНК всего 10 копий на реакцию.
- Продемонстрирована высокая эффективность амплификации целевых генов — более 99%.
Выводы
- Разработанные наборы для ОТ-ПЦР в реальном времени эффективны для мультиплексного выявления респираторных вирусов.
- Данное исследование способствует совершенствованию диагностических стратегий в вирусологических исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Мультиплексные анализы в режиме реального времени RT-qPCR для SARS-CoV-2, гриппа A/B и MERS-CoV отвечают критической потребности в быстром, чувствительном и специфическом обнаружении совместно циркулирующих респираторных вирусов в фундаментальных и трансляционных исследованиях. Эти анализы обеспечивают высокоточное дифференцирование вирусных мишеней, поддерживая надежную валидацию мишеней и снижая неопределенность на ранних этапах разработки диагностикумов. Их интеграция повышает прогностическую уверенность и операционную эффективность в рамках портфелей НИОКР, направленных на изучение угроз инфекционных заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Обеспечивает точный анализ вирусных мишеней для функциональной валидации в моделях респираторных заболеваний.
- Способствует снижению биологических рисков за счет дифференциации близкородственных вирусных патогенов в сложных образцах.
- Повышает прогностическую уверенность при выборе и сортировке мишеней для диагностических и терапевтических программ.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать валидированные системы мультиплексного анализа для последующего скрининга противовирусных соединений или диагностики.
- Обеспечивает получение стандартизированных, воспроизводимых и количественных результатов для бенчмаркинга и оптимизации анализа.
- Обеспечивает готовность к масштабируемому высокопроизводительному скринингу для быстрой оценки потенциальных терапевтических средств.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует стратегиям разработки трансляционных биомаркеров, обеспечивая одновременное обнаружение нескольких респираторных вирусов.
- Обеспечивает преемственность от этапа первичного поиска до доклинической валидации за счет надежного количественного определения вирусов.
- Снижает риски при продвижении кандидатов, гарантируя точную идентификацию патогенов в моделях, соответствующих патологии заболевания.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Мультиплексные анализы RT-qPCR являются частью континуума от этапа открытия до доклинических исследований, обеспечивая поддержку раннего тестирования гипотез, разработку методов анализа и трансляционные исследования для портфелей препаратов против инфекционных заболеваний.
- Открывающая биология: обеспечивает высокочувствительное детектирование для валидации вирусных мишеней на основе выдвинутых гипотез.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные результаты для стандартизации анализа и оценки соединений.
- Аналитика: обеспечивает получение надежных данных об амплификации и показателей специфичности для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: позволяют согласовать биомаркеры и обеспечить преемственность на различных этапах исследований.
- Корпоративное повторное использование: создает многоразовую адаптивную платформу для мультиплексного детектирования вирусов в различных условиях НИОКР.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при обнаружении вирусов.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость диагностических рабочих процессов.
- Стратегическая ценность: оптимизирует процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и эффективность использования капитала за счет обеспечения ранней и точной дифференциации патогенов.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию с учетом рисков и развитие программ по борьбе с инфекционными заболеваниями.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области молекулярной вирологии и разработки количественных ПЦР-анализов.
- Необходим доступ к оборудованию для ПЦР в реальном времени и соответствующему программному обеспечению для анализа.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами в вопросах постановки анализа, интерпретации данных и контроля качества.
- Может потребоваться адаптация метода для различных типов образцов или новых вариантов вируса.
- Эффективность метода зависит от специфичности праймеров/зондов и качества РНК в исходном материале.
