10 ноября 2023 г.
Здесь мы представляем протокол для изучения скорости инициации запрограммированной клеточной гибели путем непрерывной визуализации инокулированных листьев после индукции клеточной гибели.
Для начала перенесите зараженные вирусом растения картофеля в камеру для выращивания, поддерживаемую температурой 22 градуса по Цельсию. Выберите растение для наблюдения и используйте клейкую ленту, чтобы полностью обездвижить второй привитый лист. Далее подключите цифровой микроскоп к компьютеру и запустите программное обеспечение для захвата изображения.
Поместите лист под микроскоп. Затем с помощью диска сфокусируйтесь на поверхности листа. Чтобы настроить параметры камеры, нажмите кнопку настроек.
Теперь установите яркость на 64, контрастность на 14 и оттенок на ноль. Далее отрегулируйте баланс белого, затем установите насыщенность на 47, резкость на ноль и гамму на пять. Нажмите на значок захвата изображения и выберите опцию замедленного видео.
Затем настройте захват изображения каждые 15 минут в течение 24 часов. Нажмите кнопку «Пуск», чтобы начать захват изображения. Чтобы сохранить отснятые изображения, выберите все изображения и нажмите значок сохранения.
Теперь выберите параметры экспорта, а затем установите максимальное количество точек на дюйм. После сохранения удалите все изображения из программы. Чтобы отредактировать изображения, запустите программное обеспечение для редактирования, например ImageJ.
Нажмите на файл, затем выберите «Импорт» и выберите «Последовательность изображений», чтобы импортировать временные последовательности изображений из одного поля зрения. Вставьте путь к каталогу сохраненных картинок и нажмите кнопку ОК. Как только преобразование будет завершено, ImageJ автоматически запустит внутренний видеоплеер, отображающий готовое видео.
Нажмите на файл, затем сохраните как и выберите формат AVI для экспорта видеофайла. Когда откроется небольшое окно, установите частоту кадров 0,3 кадра в секунду, затем нажмите ОК, чтобы сохранить видео в виде файла AVI. Для цифрового микроскопического анализа использовали трех-четырехнедельные инокулированные растения картофеля с не менее чем тремя-четырьмя полностью развитыми листьями.
Одна и та же область на инокулированном листе наблюдалась с интервалом в 15 минут, чтобы определить возникновение поражения и расширение с течением времени. Через 14 часов наблюдения поражения не было обнаружено. Примерно через 90 минут было зафиксировано видимое поражение.
Поражение начало расширяться через два часа и продолжало расширяться в течение следующих восьми с половиной часов.
Это исследование изучает скорость инициации запрограммированной гибели клеток у картофельных растений с использованием непрерывного протокола визуализации для наблюдения за инокулированными листьями. Метод позволяет точно определить момент формирования поражений, предоставляя представление о динамике гиперчувствительного ответа и скрытой устойчивости.
Precise quantification of cell death initiation in plant systems enables robust hypothesis testing for genetic and molecular determinants of hypersensitive response. High-resolution digital microscopy supports predictive confidence in identifying components that modulate programmed cell death, directly impacting early discovery and target validation in plant biotechnology. This capability strengthens portfolio decisions by enabling rapid, reproducible assessment of candidate gene function in disease-relevant systems.
This digital microscopy protocol integrates into the early discovery-to-validation continuum, enabling rapid hypothesis testing and functional assessment of candidate genes or treatments in plant systems.