Изучение инициации гибели клеток с помощью цифрового микроскопа
10 ноября 2023 г.
Здесь мы представляем протокол для изучения скорости инициации запрограммированной клеточной гибели путем непрерывной визуализации инокулированных листьев после индукции клеточной гибели.
Для начала перенесите зараженные вирусом растения картофеля в камеру для выращивания, поддерживаемую температурой 22 градуса по Цельсию. Выберите растение для наблюдения и используйте клейкую ленту, чтобы полностью обездвижить второй привитый лист. Далее подключите цифровой микроскоп к компьютеру и запустите программное обеспечение для захвата изображения.
Поместите лист под микроскоп. Затем с помощью диска сфокусируйтесь на поверхности листа. Чтобы настроить параметры камеры, нажмите кнопку настроек.
Теперь установите яркость на 64, контрастность на 14 и оттенок на ноль. Далее отрегулируйте баланс белого, затем установите насыщенность на 47, резкость на ноль и гамму на пять. Нажмите на значок захвата изображения и выберите опцию замедленного видео.
Затем настройте захват изображения каждые 15 минут в течение 24 часов. Нажмите кнопку «Пуск», чтобы начать захват изображения. Чтобы сохранить отснятые изображения, выберите все изображения и нажмите значок сохранения.
Теперь выберите параметры экспорта, а затем установите максимальное количество точек на дюйм. После сохранения удалите все изображения из программы. Чтобы отредактировать изображения, запустите программное обеспечение для редактирования, например ImageJ.
Нажмите на файл, затем выберите «Импорт» и выберите «Последовательность изображений», чтобы импортировать временные последовательности изображений из одного поля зрения. Вставьте путь к каталогу сохраненных картинок и нажмите кнопку ОК. Как только преобразование будет завершено, ImageJ автоматически запустит внутренний видеоплеер, отображающий готовое видео.
Нажмите на файл, затем сохраните как и выберите формат AVI для экспорта видеофайла. Когда откроется небольшое окно, установите частоту кадров 0,3 кадра в секунду, затем нажмите ОК, чтобы сохранить видео в виде файла AVI. Для цифрового микроскопического анализа использовали трех-четырехнедельные инокулированные растения картофеля с не менее чем тремя-четырьмя полностью развитыми листьями.
Одна и та же область на инокулированном листе наблюдалась с интервалом в 15 минут, чтобы определить возникновение поражения и расширение с течением времени. Через 14 часов наблюдения поражения не было обнаружено. Примерно через 90 минут было зафиксировано видимое поражение.
Поражение начало расширяться через два часа и продолжало расширяться в течение следующих восьми с половиной часов.
Обзор
В данном исследовании изучается скорость инициации программируемой гибели клеток в растениях картофеля с использованием протокола непрерывного имиджинга для наблюдения за инокулированными листьями. Этот метод позволяет точно определить время формирования очагов поражения, что дает представление о динамике гиперчувствительного ответа в механизмах скрытой резистентности.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Инициация гибели клеток
- Реакция сверхчувствительности
- Биология растений
Теоретические основы
- Программируемая клеточная гибель является жизненно важным защитным механизмом у растений.
- В данном исследовании в качестве модельной системы используются растения картофеля.
- Определение времени наступления клеточной гибели может углубить понимание иммунитета растений.
Используемые методы
- Непрерывная визуализация инокулированных листьев
- Использование растений картофеля в качестве биологической модели
- Микроскопический анализ для наблюдения за развитием очагов поражения в режиме реального времени
Основные результаты
- Поражения стали заметны примерно через 90 минут после первоначальной инокуляции.
- Расширение поражений отслеживали в течение 8,5 часов.
- Данный метод позволяет проводить таймлапс-запись прогрессирования заболевания с высоким разрешением.
Выводы
- Данный протокол позволяет эффективно количественно определить скорость инициации гибели клеток у растений картофеля.
- Он представляет собой ценный инструмент для дальнейших исследований механизмов защиты растений от патогенов.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Точное количественное определение инициации гибели клеток в растительных системах позволяет проводить надежную проверку гипотез о генетических и молекулярных детерминантах гиперчувствительного ответа. Цифровая микроскопия высокого разрешения обеспечивает высокую достоверность при идентификации компонентов, модулирующих программируемую гибель клеток, что напрямую влияет на ранний поиск и валидацию мишеней в растительной биотехнологии. Эта возможность оптимизирует принятие решений по формированию портфеля разработок, позволяя проводить быстрый и воспроизводимый анализ функций генов-кандидатов в системах, релевантных для изучаемых заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать генетические и молекулярные факторы, влияющие на инициацию гибели клеток.
- Обеспечивает функциональную валидацию генов устойчивости и компонентов сигнальных путей.
- Способствует снижению механистических рисков путем установления связи между пертурбацией генов и фенотипическими результатами.
- Повышает прогностическую уверенность при продвижении потенциальных мишеней в рамках разработки систем устойчивости растений к заболеваниям.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированные количественные результаты визуализации для разработки анализа.
- Позволяет воспроизводимо измерять скорость инициации и расширения очагов поражения.
- Обеспечивает масштабируемость и повторное использование платформы для различных патосистем при минимальных модификациях протокола.
- Подготавливает валидированные биологические системы для последующего скрининга соединений или генетического скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет фенотипические показатели с механизмами программируемой клеточной гибели, имеющими значение для заболевания.
- Обеспечивает преемственность от генетических открытий до доклинической валидации на модельных растениях.
- Поддерживает продвижение признаков устойчивости или результатов редактирования генов в конвейерах по улучшению сельскохозяйственных культур с учетом рисков.
- Предоставляет понимание механизмов для разработки трансляционных биомаркеров в исследованиях защитных реакций растений.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол цифровой микроскопии интегрирован в начальный этап континуума «от открытия к валидации», что позволяет быстро проверять гипотезы и проводить функциональную оценку генов-кандидатов или методов лечения в растительных системах.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку нулевой гипотезы о функции гена в инициации клеточной гибели.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные данные о времени возникновения и расширении поражений для оценки готовности анализа.
- Аналитика: обеспечивает измерения с временным разрешением для сравнения генетических условий или условий обработки.
- Трансляционные исследования: связывает результаты открытий с доклинической валидацией на релевантных моделях растений.
- Корпоративное повторное использование: предлагает гибкий и экономически эффективный рабочий процесс визуализации, адаптируемый к различным патосистемам.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неоднозначность при валидации мишени.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированные, масштабируемые и воспроизводимые результаты визуализации.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), а также эффективно распределять капитал при развитии портфеля проектов.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации генетических или молекулярных вмешательств в рамках НИОКР в области растениеводства с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области культуры тканей растений и эксплуатации цифровых микроскопов.
- Необходим доступ к камерам с контролируемыми условиями выращивания и инфраструктуре для таймлапс-съемки.
- Требуется межгрупповая стандартизация интервалов визуализации и параметров анализа.
- Метод может быть адаптирован для различных видов растений и патосистем при условии внесения незначительных корректировок в протокол.
- Воспроизводимость результатов зависит от стабильности условий окружающей среды.
