ABCG5/G8 Кристаллизация в липидной бицеллярной среде для рентгеновской кристаллографии
25 августа 2023 г.
Этот протокол описывает установку для кристаллизации переносчика стерола ABCG5/G8. ABCG5/G8 восстанавливается в бицеллы для кристаллизации в виде висячей капли. Протокол не требует специализированных материалов или подложек, что делает его доступным и легким для адаптации в любой лаборатории для определения структуры белка с помощью рентгеновской кристаллографии.
Здравствуйте, моя команда изучает тип потери белка через клеточную мембрану, и мы смотрим на связь с медициной и биологией. В частности, мы рассматриваем один конкретный белок, который требует АТФ для управления своей функцией, и тогда он называется АТФ-связывающим кассетным транспортером. В частности, мы рассматриваем их фундаментальную структурно-функциональную взаимосвязь, а затем используем ее для понимания многих хронических заболеваний, особенно сердечно-сосудистых заболеваний.
Из-за сложности очистки мембранных белков и их стабильности при нативных температурах, получение 3D-кристаллов белка является основной проблемой в этой области, а также ограничивает области применения для разработки лекарств. Наша команда разработала методы крио-ЭМ и рентгеновской кристаллографии для структурных исследований белков-переносчиков мембран. Ранее наша лаборатория также исследовала кристаллическую структуру первого человеческого облигатного гетеродимера ABCG5/G8, как в апо, так и в холестерин-связанном состоянии.
Наши результаты могут стать прорывом в разработке низкомолекулярных лекарств или их перепрофилировании. Получение 3D-кристаллов белка также может позволить проводить эксперименты по замачиванию для сокристаллизации белковых и лигандных комплексов. Целью нашей лаборатории является определение молекулярных основ узнавания и транслокации липидов АТФ-зависимыми белками-переносчиками липидов.
Кроме того, мы стремимся создать новые методы в разработке лекарств для изучения молекулярной динамики и структурных аспектов транспортеров ABC.
Обзор
В данном протоколе описывается метод кристаллизации транспортера стеролов ABCG5/G8 с использованием бицелл для кристаллизации методом висячей капли. Этот подход разработан как простой и адаптируемый для различных лабораторных условий, что облегчает определение структуры белка с помощью рентгеновской кристаллографии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Структурная биология
- Мембранные транспортные белки
Теоретическая часть
- ABCG5/G8 представляет собой АТФ-связывающий кассетный транспортер, участвующий в транспорте липидов.
- Понимание его структуры имеет решающее значение для изучения хронических заболеваний, в частности сердечно-сосудистых патологий.
- Трудности при очистке мембранных белков препятствуют разработке новых лекарственных препаратов.
- В предыдущих исследованиях была расшифрована кристаллическая структура ABCG5/G8 в различных состояниях.
Цель исследования
- Изучение структурной основы распознавания и транслокации липидов ABC-транспортерами.
- Разработка новых методологий поиска лекарственных средств, связанных с мембранными транспортными белками.
- Обеспечение возможности проведения экспериментов по совместной кристаллизации для изучения белок-лигандных взаимодействий.
Используемые методы
- Химическая модификация белковых фракций посредством восстановительного метилирования.
- Использование никель-NTA колонок для очистки белка.
- Приготовление стокового раствора B-клеток для кристаллизации.
- Метод диффузии в висячей капле для постановки кристаллизации.
Основные результаты
- Успешная кристаллизация ABCG5/G8 наблюдалась в течение одной-двух недель.
- Кристаллы, пригодные для сбора данных, обычно имели размеры 50 мкм на 100 мкм на 2 мкм.
- Данная методология позволяет проводить дальнейшие исследования взаимодействий липидов и разработки лекарственных препаратов.
- Результаты способствуют пониманию взаимосвязи между структурой и функцией ABC-транспортеров.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод изучения структуры ABCG5/G8.
- Полученные результаты могут способствовать прогрессу в разработке лекарственных препаратов для лечения соответствующих заболеваний.
- Будущая работа будет сосредоточена на исследовании динамики механизмов транспорта липидов.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость
Структурное определение ABCG5/G8 с высоким разрешением в среде липидных бицелл позволяет устранить критическое препятствие в разработке лекарственных средств, нацеленных на мембранные белки. Данный подход повышает достоверность прогнозирования при валидации мишени и способствует снижению механистических рисков для портфелей препаратов, ориентированных на транспортеры. Надежная кристаллизация ABC-транспортеров обеспечивает возможность дизайна лигандов на основе структуры и ускоряет принятие решений на ранних этапах скрининга.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать механизмы АТФ-зависимых транспортеров липидов с атомным разрешением.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней за счет сохранения нативной конформации белков в средах из бицелл.
- Способствует механистическому снижению рисков для белков-транспортеров, вовлеченных в развитие хронических заболеваний.
- Предоставляет структурные шаблоны для приоритизации портфеля разработок на основе выдвинутых гипотез.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение валидированных кристаллов белка, подходящих для исследований путем замачивания лигандов и сокристаллизации.
- Стандартизирует подготовку мембранных белков для обеспечения воспроизводимости рабочих процессов последующего скрининга.
- Позволяет проводить количественную оценку белок-лигандных взаимодействий с помощью рентгеновской кристаллографии.
- Поддерживает масштабируемую разработку анализов для библиотек соединений, направленных на транспортеры.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет структурные данные с функцией транспортеров, имеющей значение при заболеваниях в рамках сердечно-сосудистых исследований.
- Обеспечивает преемственность от молекулярного поиска до доклинической валидации модуляторов транспортеров.
- Снижает трансляционный риск за счет обоснования исследований биомаркеров и механизмов действия.
- Позволяет осуществлять рациональный дизайн доклинических моделей на основе взаимосвязей между структурой и функцией транспортеров.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод кристаллизации на основе бицелл интегрируется в непрерывный процесс разработки — от ранней валидации мишени до идентификации ведущих соединений и доклинических исследований.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей функционирования ABC-транспортеров.
- Скрининг: обеспечивает получение воспроизводимых высококачественных кристаллов для скрининга на основе структуры и оценки лигандов.
- Аналитика: позволяет получать количественные структурные данные для сравнения состояний с bound-лигандом и апо-форм.
- Трансляционные исследования: связывает молекулярную структуру с активностью транспортеров при соответствующих заболеваниях и согласованием биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: создает многоразовую платформу для кристаллизации различных мембранных белков в рамках процессов разработки лекарственных средств.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования и снижает механистическую неопределенность при валидации белков-транспортеров как мишеней.
- Операционная ценность: Стандартизирует кристаллизацию мембранных белков для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает основу для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала в программах, ориентированных на транспортеры.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию мишеней-транспортеров с учетом рисков и продвигать активы, разработка которых основана на анализе структуры.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области очистки и кристаллизации мембранных белков.
- Необходим доступ к аналитической инфраструктуре для рентгеновской дифракции и характеризации белков.
- Требуется межгрупповая стандартизация протоколов приготовления бицелл и кристаллизации.
- Может потребоваться адаптация для различных семейств транспортеров или липидных составов.
- Стабильность и выход белка могут ограничивать пропускную способность и масштабируемость в некоторых системах.
