Генерация индуцированных плюрипотентных iTenoцитов, полученных из стволовых клеток, с помощью комбинированной гиперэкспрессии Склеракса и 2D одноосного натяжения
1 марта 2024 г.
В данной статье описана процедура получения iTenoцитов путем генерации мезенхимальных стромальных клеток, полученных из iPSC, с комбинированной гиперэкспрессией Scleraxis с использованием лентивирусного вектора и одноосным растяжением через 2D-биореактор.
Травма сухожилий является одной из наиболее распространенных проблем опорно-двигательного аппарата в США, от которой ежегодно страдают около 33 миллионов человек. Наши исследования сосредоточены на разработке клеточного и тканевого подхода к восстановлению сухожилий, который может значительно улучшить результаты лечения пациентов. Современные технологии, используемые для продвижения исследований сухожилий, включают использование стволовых клеток из различных источников, таких как индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, в сочетании с использованием биореакторов, биоматериалов генной инженерии и других методов тканевой инженерии для имитации сигналов окружающей среды, необходимых для сухожилия.
Наше понимание того, как сухожилия развиваются с момента их возникновения, ограничено. Существует несколько хорошо известных генов, которые очень высоко экспрессируются во время созревания сухожилий. Однако, к сожалению, они не уникальны для сухожильной ткани.
Это затрудняет исследователям стандартную оценку успешной дифференцировки сухожилий. Протокол использует замечательный потенциал дифференцировки МПК и то, что мы знаем на данный момент о развитии сухожилий. Нашей целью является разработка аллогенного источника клеток для клеточной терапии сухожилий.
Наши лаборатории сосредоточились на выяснении путей, связанных с сульфатом сухожилий, чтобы лучше понять развитие сухожилий. Мы хотим применить эти знания в сочетании с технологиями тканевой инженерии и биоматериалами для разработки более эффективных альтернатив традиционному восстановлению сухожилий.
Обзор
В данной статье рассматривается новый подход к восстановлению сухожилий с использованием мезенхимальных стромальных клеток, полученных из иПСК. Метод включает гиперэкспрессию Scleraxis с помощью лентивирусного вектора и применение одноосного растяжения в 2D-биореакторе.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Инженерия клеток и тканей
- Исследования стволовых клеток
- Биология сухожилий
Введение
- Ежегодно травмы сухожилий затрагивают миллионы людей в США.
- Современные методы лечения ограничены и часто неэффективны.
- Для восстановления сухожилий исследуется применение стволовых клеток и биореакторов.
- Понимание процессов развития сухожилий имеет решающее значение для разработки эффективных методов терапии.
Цель исследования
- Разработать метод получения iTenоцитов.
- Улучшить результаты лечения пациентов при восстановлении сухожилий.
- Изучить роль Scleraxis в созревании сухожилий.
Используемые методы
- Получение мезенхимальных стромальных клеток из иПСК.
- Оверэкспрессия Scleraxis с использованием лентивирусного вектора.
- Применение одноосного растяжения в 2D-биореакторе.
- Оценка дифференцировки и функции клеток.
Основные результаты
- Успешная генерация iТеноцитов из клеток, производных от иПСК.
- Повышенная экспрессия генов, связанных с сухожилиями.
- Улучшение функциональности клеток при механической стимуляции.
- Потенциал для разработки более эффективных стратегий восстановления сухожилий.
Выводы
- В исследовании представлен перспективный метод тканевой инженерии сухожилий.
- Оверэкспрессия Scleraxis играет ключевую роль в улучшении свойств клеток.
- Механическое растяжение в биореакторах может улучшить результаты культивирования клеток.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Создание iТеноцитов из мезенхимальных стромальных клеток, полученных из иПСК, с помощью гиперэкспрессии Scleraxis и одноосного растяжения решает проблему масштабируемости и стандартизации клеточных источников для восстановления сухожилий. Данный подход повышает прогностическую достоверность клеточной терапии за счет интеграции генетических и механических стимулов, критически важных для спецификации клеток сухожильного ряда. Метод способствует развитию портфеля разработок, обеспечивая создание воспроизводимых, готовых к использованию клеточных продуктов для регенеративного применения в опорно-двигательном аппарате.
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать пути дифференцировки сухожилий посредством контролируемой гиперэкспрессии Scleraxis.
- Способствует снижению биологических рисков путем выяснения механической роли механических и генетических стимулов в определении теногенной судьбы.
- Обеспечивает прогностическую уверенность при выборе источников клеток для портфелей регенеративной медицины.
Скрининг и разработка методов анализа
- Подготовка валидированных систем на основе iMSC для последующего функционального и фенотипического скрининга.
- Стандартизация протоколов дифференцировки для повышения воспроизводимости и количественной оценки маркеров сухожилий.
- Обеспечение масштабируемого получения iTenоцитов для разработки анализов и оценки соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает соответствие генерации теноцитов in vitro биологии сухожилий при патологиях для обеспечения трансляционной непрерывности.
- Поддерживает минимизацию рисков при разработке, предоставляя возобновляемый источник клеток для доклинических моделей восстановления сухожилий.
- Улучшает механизм снижения рисков путем установления связи между экспрессией генов, функциональными результатами и созреванием сухожилия.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный протокол интегрируется в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, обеспечивая возможность раннего тестирования гипотез, проверку готовности анализа и разработку трансляционных моделей для стратегий восстановления сухожилий.
- Открытийная биология: Обеспечивает проверку гипотез о детерминации линий сухожилий посредством Scleraxis и механической стимуляции.
- Скрининг: Предоставляет воспроизводимые количественные данные об экспрессии маркеров сухожилий и отложении коллагена.
- Аналитика: Позволяет оценивать экспрессию генов и функциональные показатели для сравнения условий дифференцировки.
- Трансляционные исследования: Связывает результаты in vitro с доклиническими моделями восстановления сухожилий с использованием стандартизированных популяций iTenocyte.
- Корпоративное повторное использование: Создает воспроизводимый рабочий процесс для генерации теногенных клеток в рамках нескольких программ НИОКР.
Операционный и организационный эффект
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при разработке методов клеточной терапии сухожилий.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированные, масштабируемые и воспроизводимые протоколы получения клеток.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет обеспечения надежной валидации источников клеток.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию активов регенеративной медицины, направленных на восстановление сухожилий, с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами иПСК, лентивирусной трансдукцией и эксплуатацией биореакторов.
- Необходим доступ к проточной цитометрии, анализу экспрессии генов и оборудованию для механической нагрузки.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов характеристики и дифференцировки клеток.
- Может потребоваться адаптация для различных моделей сухожилий или видоспецифических систем.
- Плотность клеток и параметры механической нагрузки должны быть оптимизированы для предотвращения преждевременного сокращения или гибели клеток.
