Выделение внеклеточных везикул из биожидкостей на основе химического сродства для анализа протеомики и фосфопротеомики
27 октября 2023 г.
Настоящий протокол содержит подробное описание эффективного выделения внеклеточных пузырьков мочи с использованием функционализированных магнитных шариков. Кроме того, он включает в себя последующие анализы, включая вестерн-блоттинг, протеомику и фосфопротеомику.
Мы работаем над открытием биомаркеров на основе внеклеточных везикул. Одним из важных шагов является их эффективная и избирательная изоляция. EVtrap, который основан на разделении на основе магнитных шариков, действительно может помочь нам, обеспечивая высокую пропускную способность, прост в использовании, в частности, прост в клиническом применении.
Мы использовали этот протокол для обнаружения белков и фосфопротеиновых биомаркеров для различных заболеваний, таких как рак молочной железы, рак почек и болезнь Паркинсона. Этот биомаркер получают из биожидкости. Электромобили потенциально могут быть использованы для жидкостной биопсии, что может еще больше улучшить клиническую диагностику и лечение.
В настоящее время наиболее часто используемыми методами выделения внеклеточных везикул являются ультрацентрифугирование и осаждение, но эти методы ограничены совместным выделением загрязняющих веществ и также низкой эффективностью. Таким образом, наш метод EVtrap обеспечит более эффективный способ изоляции электромобилей, что позволит использовать более воспроизводимый и чувствительный метод, а также принесет пользу последующему анализу. Мы работаем над двумя вещами.
Во-первых, мы продолжаем развивать методы и протоколы изоляции электромобилей и нисходящий анализ, в частности, анализ на основе массового резервного копирования. Во-вторых, мы изучаем различные варианты применения в клинической области из-за преимущества EVtrap.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается эффективный метод выделения внеклеточных везикул (ВВ) мочи с использованием функционализированных магнитных частиц. Также подробно описаны последующие этапы анализа, такие как вестерн-блоттинг, протеомика и фосфопротеомика, которые необходимы для поиска биомаркеров.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Поиск биомаркеров
- Внеклеточные везикулы
Теоретические основы
- Внеклеточные везикулы имеют важное значение для жидкостной биопсии.
- Они могут дать представление о различных заболеваниях.
- Эффективная изоляция имеет решающее значение для клинического применения.
- Белки и фосфопротеины из биологических жидкостей являются потенциальными биомаркерами.
Цель исследования
- Для ускорения поиска биомаркеров.
- Для эффективного и селективного выделения внеклеточных везикул (EVs).
- Для улучшения клинической диагностики и лечения.
Используемые методы
- Выделение внеклеточных везикул мочи с помощью магнитных бусин.
- Вестерн-блоттинг для анализа белков.
- Протеомика и фосфопротеомика для идентификации биомаркеров.
- Высокопроизводительные методы для клинического применения.
Основные результаты
- Успешное выделение внеклеточных везикул (EVs) из биологических жидкостей.
- Идентификация белков и фосфопротеинов, связанных с заболеваниями.
- Продемонстрированный потенциал для применения в жидкостной биопсии.
- Содействие в поиске биомаркеров рака и болезни Паркинсона.
Выводы
- Данный протокол повышает эффективность выделения внеклеточных везикул (EV).
- Он способствует поиску клинически значимых биомаркеров.
- Обладает потенциалом для совершенствования диагностических и терапевтических стратегий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Эффективное и селективное выделение внеклеточных везикул (EVs) из биологических жидкостей является критически важным этапом для поиска биомаркеров на основе протеомики в биофармацевтических исследованиях и разработках. Данный протокол с использованием магнитных частиц на основе химического аффинитета обеспечивает воспроизводимое выделение EVs с высоким выходом, что напрямую способствует проведению количественного протеомного и фосфопротеомного анализа, необходимых для ранней диагностики заболеваний и валидации мишеней. Этот метод повышает точность прогнозирования в трансляционных конвейерах биомаркеров и поддерживает продвижение портфеля проектов с учетом рисков.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Обеспечивает надежный анализ сигнатур белков и фосфопротеинов, имеющих значение при заболеваниях, в биожидкостях, полученных от пациентов.
- Поддерживает функциональную валидацию мишеней, предоставляя высококачественный груз EV для последующих механистических исследований.
- Способствует снижению биологических рисков за счет воспроизводимого и количественного молекулярного профилирования.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение стандартизированных высокочистых препаратов EV, подходящих для количественного масс-спектрометрического анализа.
- Повышает воспроизводимость и чувствительность анализа за счет минимизации количества загрязнений и максимизации выхода EV.
- Обеспечивает масштабируемую подготовку образцов EV для высокопроизводительного скрининга и повторного использования платформы.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует стратегиям трансляционных биомаркеров, обеспечивая получение молекулярных «снимков» биожидкостей пациентов в режиме реального времени.
- Обеспечивает преемственность этапов от поиска до доклинической валидации за счет возможности последовательного анализа протеома и фосфопротеома EV.
- Позволяет снизить механистические риски для потенциальных биомаркеров перед началом клинической разработки.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный протокол выделения EV объединяет начальный этап поиска и трансляционные исследования, связывая подготовку образцов с количественным протеомным и фосфопротеомным анализом.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей, обеспечивая доступ к молекулярному содержимому внеклеточных везикул (ВВ).
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные образцы ВВ для разработки последующих анализов и оценки соединений.
- Аналитика: обеспечивает высокопроизводительное, статистически достоверное измерение содержания белков и фосфопротеинов при различных условиях.
- Трансляционные исследования: обеспечивают согласованность биомаркеров и преемственность данных при переходе от образцов пациентов к доклиническим моделям.
- Корпоративное повторное использование: создает стандартизированную масштабируемую возможность выделения ВВ для различных программ НИОКР.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность при поиске биомаркеров.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированное, воспроизводимое и масштабируемое выделение EV для протеомных исследований.
- Стратегическая ценность: улучшает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет обеспечения надежного молекулярного профилирования.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков и продвижению кандидатов в биомаркеры и терапевтические средства.
Особенности реализации
- Для оптимального выполнения и интерпретации данных требуются экспертные знания в области протеомики, фосфопротеомики и биологии внеклеточных везикул (EV).
- Необходим доступ к системам разделения на основе магнитных частиц и платформам масс-спектрометрии высокого разрешения.
- Для обеспечения воспроизводимости требуется межкомандная стандартизация процедур обработки образцов и аналитических протоколов.
- Метод применим к различным типам биожидкостей, но может потребовать оптимизации для разных матриц.
- Количественная воспроизводимость и чувствительность зависят от строгого соблюдения протокола и аналитической калибровки.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:47
Extracellular Vesicle (EV) Isolation from Human Urine Samples Using the EVtrap Approach
3:39
Preparation of Dried Extracellular Vesicle (EV) Sample for Proteomics and Phosphoproteomics Analysis
6:31
Proteome/Phosphoproteome Analysis of the Extracellular Vesicle (EV) Samples Using LC‐MS/MS
