Тканевая обработка и выделение первичных фибробластов из влагалища человека
22 ноября 2024 г.
Этот протокол демонстрирует надежную и эффективную технику выделения первичных фибробластов из тканей влагалища человека в пременопаузе или постменопаузе. Существующие протоколы выделения вагинальных фибробластов не учитывают проблемы выделения клеток из стареющих тканей. Ткань влагалища была получена от женщин после операции по удалению пролапса тазовых органов.
Исследования расстройств, которые в первую очередь затрагивают людей женского пола, недостаточно изучены и недостаточно финансируются. Пролапс тазовых органов – это заболевание, тесно связанное с женским полом. Он возникает, когда мышцы и связки ослабевают и заставляют органы малого таза опускаться ниже в области таза, создавая выпуклость во влагалище.
Мало что известно о клеточных взаимодействиях в контексте этой патофизиологии, а также о том, как факторы на уровне тканей влияют на успех хирургических вмешательств. Выделение первичных фибробластов из влагалища человека может быть полезным для изучения биологических механизмов, лежащих в основе опущения тазовых органов. Пролапс тазовых органов обычно поражает пожилых людей или лиц в постменопаузе.
Изучение выделения и пролиферации первичных фибробластов этого состояния затруднено из-за снижения клеточных популяций и клоногенной способности более старых доноров. В большинстве работ с использованием образцов человеческого влагалища используются ткани женщин в пременопаузе с пролапсом тазовых органов. Хотя в нескольких работах сообщалось об использовании образцов как в пременопаузе, так и в постменопаузе, они не описывали достаточно подробно протокол, используемый для успешной изоляции фибробластов от пожилых доноров или доноров в постменопаузе.
Выделение и моделирование заболевания с использованием фибробластов из тканей постменопаузы может иметь важное значение для понимания клеточной патофизиологии пролапса тазовых органов, поскольку это состояние имеет наибольшую распространенность у людей в течение десятилетия после менопаузы. В этой статье описан надежный протокол о том, как приобрести вагинальные фибробласты человека в постменопаузе или стареющем состоянии. Собранные ткани были проанализированы гистологически для валидации протокола.
Измерьте и разрежьте ткань до размера примерно одного квадратного сантиметра. Обеспечьте точное измерение размера биопсии. Подготовьте две-три дополнительные биопсии влагалища, измеряя один квадратный сантиметр каждая, от одного донора и отложите биопсию.
После помещения биопсии влагалища в чашку Петри для клеточной культуры измельчите ткань влагалища на мелкие фрагменты, используя два стерильных скальпеля. Убедитесь, что кончики лезвий расположены перпендикулярно поверхности ткани. Равномерное и равномерное давление надавите на поверхность ткани с помощью двух скальпелей.
Выполняйте попеременное тянущее действие, чтобы разрезать ткани на очень мелкие кусочки. Повторяйте эту технику измельчения с помощью двух скальпелей до тех пор, пока образец не станет однородным по консистенции из одного-двух миллиметровых кусочков. Добавьте в тарелку два-три миллилитра бессывороточной клеточной питательной среды, суспензируя измельченную ткань.
Пипеткой впрыскивайте раствор, содержащий фрагменты ткани, вверх и вниз, чтобы разбить любые комки. Переложите раствор, содержащий фрагменты ткани, в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Добавляйте дополнительные бессывороточные среды для клеточных культур до тех пор, пока общий объем не составит 10 миллилитров.
Храните Либеразе в 230 микролитровых аликвотах для использования. Добавьте в тюбик 230 микролитров Либераче. Инкубируйте пробирки в течение трех часов при температуре 37 градусов Цельсия при постоянном энергичном перемешивании, используя смеситель для образцов.
Поддерживайте постоянное возбуждение. Делайте вихревые движения трубок с 30-минутными интервалами во время инкубации. Центрифугируйте образцы в течение пяти минут при 3000 G. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость.
Повторно суспендируйте гранулу в одном-двух миллилитрах среды для клеточных культур с 10% фетальной бычьей сывороткой для разбавления либеразы. Энергично пипетируйте до тех пор, пока гранула не будет полностью восстановлена. Процедите суспензию тканевого фермента, аккуратно нанеся раствор пипетированием на клеточное ситечко.
Соберите клеточные суспензии из нескольких биопсий тканей одного и того же донора. С помощью поршня стерильного пятимиллилитрового шприца продавите через ткань суспензию фермента над ситечком. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока оставшиеся фрагменты ткани не будут полностью продавлены.
Пластина извлекала клеточную суспензию из нескольких биопсий влагалища от одного и того же донора на одной чашке Петри. После ночной инкубации при 37 градусах Цельсия наблюдайте за клетками с помощью фазово-контрастного микроскопа. Обеспечьте фокусировку микроскопа на нижней части пластины.
Небольшое количество фибробластов будет прикреплено к дну. Ниже приведено схематическое представление протокола с выделением ключевых шагов. На втором рисунке показано фазово-контрастное изображение взвешенных клеток в нулевой день.
На рисунке 3 представлено фазово-контрастное изображение первичных фибробластов влагалища на 14-й день посева при 100-кратном увеличении из вытянутой суспензии трех биопсий ткани площадью один сантиметр квадратный. В таблице 1 представлены результаты использования других протоколов для попытки выделения вагинальных фибробластов в данном исследовании. Фибробласты были идентифицированы по положительному окрашиванию ментона.
Иммунофлуоресцентный анализ был проведен на тканях влагалища в пременопаузе и постменопаузе, показанных здесь. Снимки были сделаны с 200-кратным увеличением. Выделенные фибробласты также окрашивали альфа-гладкомышечным актином и F-актином в образцах тканей в пременопаузе и постменопаузе.
Мы разработали оптимизированный и надежный протокол выделения первичных фибробластов из слизистой оболочки влагалища у пожилых доноров. Использование ранее опубликованных протоколов для тканей животных и человека для диссоциации первичных клеток не привело к извлечению фибробластов из образцов влагалища человека в данном исследовании. Мы предполагаем две вероятные причины проблем с диссоциацией клеток из тканей влагалища человека.
Толщина слизистой оболочки кожи у пожилых доноров больше у пожилых доноров и по сравнению с толщиной ткани, не относящейся к слизистой оболочке, а плотность фибробластов может быть заметно снижена у пожилых людей. Не следует изменять несколько критически важных шагов. Осуществление очень строгого механического разложения с использованием техники двух скальпелей и объединение клеточных суспензий трех-четырех биопсий полной толщины одного донора.
Наш протокол имеет явное преимущество. Механическое и ферментативное расщепление приводит к лучшему выходу для тканей в постменопаузе, но не оказывает негативного влияния на образцы в пременопаузе. Мы признаем несколько ограничений нашего протокола.
Доступ к ткани влагалища человека может быть затруднен в ситуациях, когда операция по удалению вагинального пролапса не проводится, а необходимость забора клеточных суспензий из нескольких образцов биопсии ткани также может быть ограничением. Этот протокол для требования вагинальных фибробластов человека станет полезным инструментом для будущих исследований заболеваний тазового дна, особенно у лиц в постменопаузе, а также важным дополнением к исследованиям в области женского здоровья.
Обзор
Это исследование представляет надежный протокол для выделения первичных фибробластов из человеческой вагинальной ткани, специально решающий проблемы, связанные с старением и менопаузой. Метод сочетает механическую и ферментативную диссоциацию для повышения выхода фибробластов как из доноров до менопаузы, так и после нее.
Ключевые компоненты исследования
Область исследования
- Изоляция первичных фибробластов
- Исследования пролапса органов малого таза у женщин
- Клеточные взаимодействия при старениии
Предыстория
- Пролапс органов малого таза в основном затрагивает постменопаузальных женщин.
- Клеточные взаимодействия при этом состоянии плохо изучены.
- Существующие протоколы для выделения фибробластов недостаточно хорошо решают проблемы, связанные со старой тканью.
Использованные методы
- Механические и ферментативные методы расщепления
- Человеческая вагинальная ткань, полученная от доноров до и после менопаузы
- Гистологический анализ для валидации протокола
Основные результаты
- Был разработан надежный метод для выделения фибробластов от обоих типов доноров.
- Культуры фибробластов были успешно достигнуты с оптимальными выходами.
- Изменения в протоколе значительно улучшили результаты по сравнению с предыдущими методами.
Выводы
- Исследование подчеркивает важность разработки специализированных методов для выделения фибробластов из старой ткани.
- Это исследование способствует лучшему пониманию патофизиологии пролапса органов малого таза и поддерживает будущие исследования в этой области.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Reliable isolation of primary human vaginal fibroblasts from both premenopausal and postmenopausal donors addresses a critical gap in disease-relevant model development for pelvic organ prolapse research. This protocol enables standardized cellular studies across age groups, supporting mechanistic de-risking and translational continuity in women's health R&D. The method enhances predictive confidence for downstream assay development and target validation in tissue remodeling and host-microbiome interaction studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular mechanisms underlying pelvic organ prolapse using age-relevant human fibroblasts.
- Supports functional target validation by providing consistent primary cell sources from diverse donor backgrounds.
- Facilitates mechanistic de-risking by modeling disease-relevant tissue environments.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible fibroblast preparations for quantitative assay development.
- Improves assay reliability by ensuring consistent cell yields from both premenopausal and postmenopausal tissues.
- Enables scalable preparation of primary cells for compound screening and functional studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with the clinical demographic most affected by pelvic organ prolapse.
- Supports translational biomarker discovery by enabling studies in primary cells from older donors.
- Reduces biological risk in preclinical validation by using disease-relevant human tissue sources.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a robust method for generating primary fibroblast cultures from clinically relevant human tissue.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing on tissue remodeling and cellular interactions in pelvic organ prolapse.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cell-based assay platforms for compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative measurement of fibroblast yield and phenotype across donor ages.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical studies with age-matched primary cell models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable protocol for primary fibroblast isolation applicable to multiple research programs in women's health.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in disease modeling.
- Operational Value: Standardizes fibroblast isolation across donor ages, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions for target and biomarker programs in pelvic floor disorders.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of women's health research initiatives.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, mechanical and enzymatic dissociation, and primary cell culture.
- Needs access to surgical human vaginal tissue, particularly from postmenopausal donors.
- Demands standardized instrumentation for tissue processing and cell culture analytics.
- May require adaptation for use with limited tissue availability or alternative biopsy sources.
- Pooling of multiple biopsies per donor is necessary for optimal cell yield, as supported by the protocol.
