Количественная оценка антителозависимой клеточной цитотоксичности в модели сфероида опухоли: заявка на разработку лекарственного препарата

Одна из самых эффективных таргетных терапий рака основана на антителах, таких как антитела к HER2 трастузумаб. Противораковое действие трастузумаба включает антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность, ADCC, естественными киллерами или NK-клетками. Понимание механизмов, регулирующих чувствительность раковых клеток к терапии антителами к рецепторам фактора роста, с особым вниманием к ADCC, может иметь решающее значение для разработки новых, более эффективных методов лечения.

3D-модели, такие как сфероиды раковых клеток, доказали свое превосходство в прогнозировании иммунного ответа опухолей на различные противораковые препараты. Поэтому мы создали модель сфероида ADCC, используя линию естественных клеток-киллеров NK92, GFP-экспрессирующие клетки карциномы молочной железы JIMT-1 и трастузумаб. Мы настроили систему анализа ADCC, индуцируя анти-HER2-положительные клетки карциномы молочной железы JIMT-1 для формирования трехмерных кластеров, называемых сфероидами.

Клеточная линия JIMT-1, используемая в экспериментах, стабильно экспрессирует зеленый флуоресцентный белок. Начинаем эксперимент с подготовки 96-луночной пластины к формированию сфероидов. Для создания U-образного и клеточно-отталкивающего дна 96-луночную пластину покрыть раствором 0,5%-ной агарозы в ПБС.

Инкубируйте планшет при комнатной температуре примерно от 30 до 45 минут. Тем временем трипсинизацию и подсчитывают клетки JIMT-1 для клеточного посева. Промойте клетки двумя миллилитрами стерильного ПБС.

Добавьте в колбу два миллилитра трипсина-ЭДТА и поместите колбу обратно в CO2-инкубатор на 10 минут. После инкубации постучите по колбе, чтобы проверить, отделились ли клетки JIMT-1. Остановите сбраживание двумя миллилитрами среды JIMT-1 и соберите клеточную суспензию в 50-миллилитровую пробирку.

Подсчитайте количество клеток с трипановым синим в камере Беркера и отрегулируйте количество клеток до 20 000 клеток на мл. Засейте клетки в 96-луночную пластину, пипетируя 100 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку для образования сфероидов. Дайте клеткам слипаться в течение трех дней инкубации при температуре 37 градусов в CO2-инкубаторе.

Регулярно проверяйте размер и форму сфероидов с помощью инвертированного микроскопа. На третий день после индукции сфероидов покройте 96-луночный скрининговый планшет с высоким содержанием раствором Pluronic F-127 в ДМСО. Покрытие имеет решающее значение для предотвращения прилипания сфероидов JIMT-1 EGFP к поверхности стекла или пластине.

После инкубационного периода продолжительностью 45 минут при комнатной температуре отсасывайте раствор покрытия и дважды промойте лунки безсывороточным материалом DMEM F12. Перенесите сфероиды на 96-луночный скрининговый планшет с высоким содержанием в трех экземплярах с помощью пипетки объемом один миллилитр. Добавляют сунитиниб в лунки с концентрацией 40 микромоляров в 10 микролитров на лунку, а пипетку свежей среды ДЖИМТ-1 в контрольные лунки для увеличения объема.

Инкубируйте планшет в течение одного часа в СО2-инкубаторе при температуре 37 градусов. Пока идет инкубация предварительно обработанных сфероидов, соберите клетки NK92 из колбы в 15-миллилитровую пробирку. Подсчитайте количество клеток с трипановым синим в камере Беркера и отрегулируйте количество клеток так, чтобы достичь соотношения эффектора к мишени 20 к 1.

Окрасьте NK-клетки 10-микромолярным раствором CellTracker Blue и поместите их в CO2-инкубатор на один час при температуре 37 градусов. Чтобы смыть излишки красителя, центрифугируют NK-клетки дважды при 150 RCF в течение трех минут при комнатной температуре. Затем повторно суспендируйте ячейки в свежей среде JIMT-1.

Добавьте окрашенные NK-клетки к целевым сфероидам JIMT-1 EGFP путем пипетирования 55 микролитров на лунку вместе с трастузумабом на антитела к HER2. Разбавляют трастузумаб в среде JIMT-1 до концентрации 10 мкг на мл. Добавьте 110 микролитров свежей среды JIMT-1 в контрольные лунки и инкубируйте планшет в течение 24 часов в CO2-инкубаторе при температуре 37 градусов.

В результате общий объем обработки, добавленной для ADCC, составляет 110 микролитров, а конечная концентрация сунитиниба составляет 20 микромолей на литр. Чтобы обнаружить и измерить апоптотическую гибель клеток после лечения, окрасьте сфероиды конъюгатом Annexin V Alexa Fluor 647 в течение одного часа в среде JIMT-1. После завершения экспериментальных этапов перенесите планшет на анализирующее устройство с высоким содержанием вещества.

Планшет визуализируют через 24 часа после добавления NK-факторов к клеткам-мишеням. Для визуализации мы используем анализатор высокого содержания и программное обеспечение для анализа изображений. Выберите тип микропластины из списка пластин с помощью параметра Тип пластины.

Используйте 96-луночную просеивающую пластину с высоким содержанием. Выберите два пиковых автофокуса в качестве анализов, выполняемых на планшетах с 10-кратным объективом с числовой апертурой 0,3, используя параметры автофокусировки и объектива соответственно. Выберите конфокальный режим с параметром OptiMode и примените Биннинг 2 к параметру Биннинг.

Для получения изображений сфероидов выберите соответствующие каналы с помощью параметра «Выбор канала». Для обнаружения клеток JIMT-1, перелитых с помощью EGFP, выберите EGFP со временем интегрирования 200 миллисекунд, мощностью лазера 50%, высотой стека два микрометра, возбуждением 488 нанометров и длиной волны излучения 500, 550 нанометров. А для обнаружения апоптотических клеток используйте Alexa 647 со временем интегрирования 100 миллисекунд, мощностью лазера 50%, высотой стека 10 микрометров, возбуждением 640 нм, длиной волны излучения 650, 760 нанометров.

Чтобы визуализировать NK-ячейки внутри сфероидов, выберите следующий канал: DAPI со временем интегрирования 100 миллисекунд, мощностью лазера 50%, высотой стека два микрометра, возбуждением 405 нанометров и длиной волны излучения 435, 418 нанометров. В опции Layout Selection выберите стеки Z, так как ячейки в сфероидах имеют тенденцию находиться в разных фокальных плоскостях микроскопа. 10 плоскостей с расстоянием 10 микрометров достаточно, чтобы покрыть всю область сфероида.

Установите значения первой и последней плоскостей на 0 мкм и 90 мкм соответственно. Перед началом измерения с помощью функции «Моментальный снимок» можно сделать снимки образцов, чтобы проверить правильность настроек. Задайте количество лунок и полей для визуализации с помощью параметра Defined Layout.

Идентификация сфероидов по флуоресценции EGFP или клеткам JIMT-1 с помощью опции Fine Texture Region и фильтрация по размеру. Удалите объекты границ с помощью модуля «Выбор популяции». Поскольку аннексин-положительные клетки появляются на периферических сфероидах, измерьте интенсивность аннексина в апоптотическом кольце.

В модуле «Выбор региона» задайте для параметра «Внешняя граница» значение минус 90. Выразите значения интенсивности Annexin как среднюю интенсивность. Как показало окрашивание аннексином V, добавление NK-клеток и трастузумаба к клеткам JIMT-1 вызывало гибель клеток в опухолевых сфероидах.

Аннексин-позитивные апоптотические клетки появились в периферической зоне сфероидов. Однако в отсутствие трастузумаба NK-клетки не запускали апоптоз опухолевых клеток. Для дифференциации между прямыми или ADCC-опосредованными эффектами трастузумаба в качестве отрицательного контроля использовали трастузумаб-Fab2, не обладающий способностью связывать ФК-регионы.

Поскольку трастузумаб-Fab2 был неэффективен в этой модели, гибель опухолевых клеток, вероятно, опосредована через ADCC. Кроме того, предварительная обработка сунитинибом снижала окрашивание аннексина V в сфероидах, подтверждая индуцированную сунитинибом резистентность ADCC и выявляя предотвращение апоптотической гибели клеток в сфероидах JIMT-1, инкубированных совместно с NK-клетками и трастузумабом. Эти данные подтвердили цитопротекторный эффект сунитиниба в модели ADCC и призывают к осторожности в отношении потенциальных комбинаций иммунотерапии на основе ADCC и сунитиниба.

Таким образом, наш анализ HCS может быть подходящим для идентификации соединений, повышающих ADCC.