Автоматизированное вибратомное секционирование легочной ткани, внедренной агарозой, для мультиплексной флуоресцентной визуализации
6 октября 2023 г.
Мы разработали технику обработки тканей с использованием вибратома и легочной ткани, внедренной агарозой, для создания срезов легких, что позволяет получать изображения архитектуры легких с высоким разрешением. Мы использовали иммунофлуоресцентное окрашивание для наблюдения за пространственной экспрессией белка с использованием специфических структурных маркеров легких.
Этот протокол особенно полезен на крупных животных моделях трансплантации и регенерации легких, таких как свиньи, где мы можем брать образцы небольших кусочков в течение долгого времени. Этот метод может помочь нам лучше понять пространственную биологию, используемую в этих моделях. Этот метод позволяет получить минимально обработанные срезы легких, пригодные для иммунофлуоресцентной визуализации без необходимости извлечения антигена, и был эффективен со всеми антителами, протестированными на сегодняшний день.
Эта процедура может быть адаптирована для вырезания немного более толстых срезов, скажем, около одного миллиметра, которые затем могут быть использованы в светолистовой флуоресцентной микроскопии для изучения пространственной экспрессии белка в более трехмерном объеме. В нашем исследовании изучаются факторы, влияющие на отторжение трансплантата легких, и разрабатываются методы лечения для уменьшения отторжения с использованием нашей модели свиньи. Этот метод помогает понять пространственные изменения белка, влияющие на результаты трансплантации после операции.
В настоящее время мы используем этот метод для изучения ландшафта пространственной экспрессии белка в нашей модели трансплантации легких свиньи. Мы надеемся, что это поможет нам лучше понять механизмы, лежащие в основе наших экспериментальных методов лечения. Ключ к успеху здесь заключается в вибратомных наблюдениях, высоких амплитудах лопастей и более низких силовых скоростях, на которые следует обратить внимание, если секционирование идет плохо.
Обзор
В данном исследовании представлена новая методика обработки тканей с использованием вибратома и легочной ткани, погруженной в агарозный блок, для получения срезов легких с высоким разрешением. Этот метод позволяет проводить иммунофлуоресцентное окрашивание для изучения пространственной экспрессии белков в архитектуре легких.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология
- Трансплантация легких
Теоретические основы
- Понимание пространственной биологии в моделях легких имеет решающее значение для изучения трансплантации легких.
- Данный метод позволяет получать минимально обработанные срезы легких, подходящие для визуализации.
- Метод оказался эффективным при использовании различных антител без необходимости проведения ретривации антигена.
- Подходит для подготовки более толстых срезов для применения передовых методов визуализации.
Цель исследования
- Изучить факторы, влияющие на отторжение трансплантата легкого.
- Разработать методы терапии, направленные на снижение частоты отторжения при трансплантации легких.
- Исследовать пространственную экспрессию белков на модели трансплантации легкого свиньи.
Используемые методы
- Заливка легочной ткани в агарозу для последующего секционирования.
- Использование вибратома для получения срезов легкого заданной толщины.
- Иммунофлуоресцентное окрашивание для визуализации экспрессии белков.
- Сравнительный анализ распределения пневмоцитов второго типа в образцах человека.
Основные результаты
- Успешное получение срезов легких с высоким разрешением.
- Идентификация пространственных изменений белков, влияющих на исходы трансплантации.
- Более высокое количество пневмоцитов второго типа и степень покрытия матрикса в образцах младенцев по сравнению со взрослыми.
- Эффективное применение метода для различных образцов тканей легких.
Выводы
- Метод использования вибратома расширяет понимание архитектуры легкого.
- Он позволяет изучить пространственную экспрессию белков, имеющую значение для биологии трансплантации.
- Данный метод может способствовать дальнейшим исследованиям в области трансплантации и регенерации легких.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Автоматическое секционирование легочной ткани, погруженной в агарозу, с помощью вибратома позволяет получать воспроизводимые, минимально обработанные срезы легкого для мультиплексного флуоресцентного имиджинга для различных видов. Данный рабочий процесс решает проблему сохранения естественной архитектуры легкого и антигенности, обеспечивая высококонтентный пространственный анализ белков, который имеет решающее значение для трансляционных исследований легких. Этот подход повышает прогностическую достоверность доклинических моделей легких и дает основу для изучения механизмов повреждения, регенерации и исходов трансплантации.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Позволяет исследовать пространственную экспрессию белков в нативной ткани легкого для снижения механистических рисков.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней за счет сохранения антигенности без необходимости демаскировки антигенов.
- Облегчает проведение сравнительных исследований образцов мышей, свиней и людей для подтверждения достоверности мишеней при межвидовом переносе.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение стандартизированных и воспроизводимых срезов легких, подходящих для мультиплексного иммунофлуоресцентного анализа.
- Позволяет получать количественные пространственные данные о локализации и содержании белков.
- Обеспечивает масштабируемость анализа и возможность повторного использования платформы для валидации и скрининга антител.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям, имеющим значение для изучения заболеваний, включая трансплантацию легких и повреждения у крупных животных.
- Поддерживает поиск трансляционных биомаркеров, обеспечивая пространственное картирование изменений белков с высоким разрешением.
- Способствует продвижению экспериментальных методов терапии с учетом рисков благодаря пониманию механизмов ремоделирования тканей и отторжения.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод охватывает все этапы от первичного поиска до доклинической валидации, поддерживая рабочие процессы в исследованиях повреждения, регенерации и трансплантации легких.
- Открытия в биологии: развитие проверки гипотез о пространственной динамике белков в сохраненной архитектуре легких.
- Скрининг: получение воспроизводимых количественных результатов визуализации для оценки антител и биомаркеров.
- Аналитика: возможность статистического сравнения распределения белков и численности типов клеток при различных условиях и на разных стадиях развития.
- Трансляционные исследования: перенос доклинических данных, полученных на моделях животных, на анализ тканей человека для сопоставления биомаркеров.
- Повторное использование в организации: создание многоразовой платформы для обработки тканей и визуализации, адаптируемой к различным программам исследований легких.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования и снижает неопределенность механизмов в исследованиях легочной ткани.
- Операционная ценность: стандартизирует обработку тканей и визуализацию для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости различных проектов.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки («go/no-go») за счет обеспечения надежного пространственного анализа белков в трансляционных моделях.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию терапевтических средств для воздействия на легкие и программ по поиску биомаркеров с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с вибратомом и проведения иммунофлуоресцентной визуализации.
- Необходим доступ к вибратому и системе мультиплексной флуоресцентной микроскопии.
- Для обеспечения воспроизводимости результатов требуется межгрупповая стандартизация протоколов нарезки и окрашивания.
- Метод применим к различным моделям легких, но может потребовать оптимизации толщины тканей и совместимости антител.
- Параметры нарезки и правила обращения с тканями должны строго контролироваться для сохранения нативной структуры и антигенности.
