Идентификация и анализ миогенных предшественников in vivo при остром повреждении скелетных мышц методом многомерной одноклеточной массовой цитометрии
1 декабря 2023 г.
Представленный здесь протокол позволяет проводить идентификацию и многомерный анализ мышечных стволовых и прогениторных клеток с помощью одноклеточной массовой цитометрии и их очистку с помощью FACS для углубленного изучения их функции. Этот подход может быть применен для изучения динамики регенерации в моделях заболеваний и проверки эффективности фармакологических вмешательств.
В нашем исследовании изучаются молекулярные механизмы, лежащие в основе дисфункции стволовых клеток при старении и болезнях. Наша цель состоит в том, чтобы понять, как мышечные стволовые клетки и клетки-предшественники взаимодействуют с другими клетками в мышечном микроокружении для достижения эффективной регенерации. Мы также изучаем, влияет ли бесплодная клеточная коммуникация на функцию мышечных стволовых клеток при старении и болезнях.
Основным препятствием для исследования межклеточной коммуникации в нише стволовых клеток является отсутствие технологий, обеспечивающих разрешение одной клетки. Одноклеточная массовая цитометрия позволяет одновременно проводить высокопроизводительный количественный анализ нескольких типов клеток и молекулярных фенотипов в сложных тканях. Наш протокол позволяет проводить очистку и глубокое профилирование редких стволовых клеток и потомства во время регенерации мышц с использованием антител к маркерам клеточной поверхности и миогенным факторам транскрипции.
Изучение этих клеток помогает нам понять, как контролируется судьба мышечных стволовых клеток, и выявить сети, которые управляют переходами состояния клеток, обеспечивая эффективную регенерацию. Одновременное измерение до 50 клеточной поверхности и внутриклеточного белка на уровне одной клетки является ценным подходом к исследованию клеточной функции в мышечной ткани. Этот метод может идентифицировать уникальные молекулярные сигнатуры и выявить новые механизмы дисфункции мышечных стволовых клеток при старении и заболеваниях.
Этот протокол позволяет исследовать, как переход из одного состояния клетки влияет на регенерацию тканей в норме и при заболеваниях. Сигнатура активированных стволовых клеток, которую мы представляем здесь, позволяет изучать состояние покоя стволовых клеток. Ранее они были невозможны.
Теперь мы можем очищать активированные стволовые клетки, CD98 High, CD44 High, основываясь исключительно на маркере клеточной поверхности, и впервые изучить, как они возвращаются в состояние покоя.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучаются молекулярные механизмы дисфункции стволовых клеток и клеток-предшественников мышц при старении и заболеваниях. С помощью масс-цитометрии отдельных клеток и метода FACS исследуется взаимодействие этих клеток в микроокружении мышц, а также их роль в динамике регенерации, что позволяет получить представление о возможных терапевтических методах вмешательства.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Биология мышц
- Функции стволовых клеток
- Динамика регенерации
Теоретические сведения
- Дисфункция стволовых клеток влияет на регенерацию тканей при старении и заболеваниях.
- Эффективная межклеточная коммуникация имеет решающее значение внутри ниши стволовых клеток.
- Предыдущие технологии не обладали разрешением на уровне отдельных клеток для детального изучения.
Используемые методы
- Масс-цитометрия единичных клеток для многомерного анализа.
- FACS (флуоресцентно-активированная сортировка клеток) для очистки клеток.
- Модели мышей in vivo для исследований регенерации.
Основные результаты
- Идентификация уникальных молекулярных сигнатур в стволовых клетках мышц.
- Понимание механизмов покоя и реактивации стволовых клеток.
- Характеристика переходов между состояниями клеток, имеющих важное значение для эффективной регенерации.
Выводы
- Данное исследование демонстрирует эффективность применения передовых методов цитометрии для изучения биологии стволовых клеток мышц.
- Полученные результаты имеют значение для разработки терапевтических стратегий лечения возрастной дегенерации мышц.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Высокоразмерная масс-цитометрия отдельных клеток позволяет точно идентифицировать и профилировать миогенные прогениторы и стволовые клетки при остром повреждении скелетных мышц, восполняя критический пробел в понимании динамики регенерации. Эта возможность повышает точность прогнозирования при валидации мишеней и снижении механистических рисков для портфелей препаратов для лечения мышечных заболеваний и регенеративной медицины. Данный подход способствует принятию обоснованных решений по развитию проектов с учетом рисков, предоставляя количественные и воспроизводимые данные о клетках, имеющие значение для ранних этапов поиска и трансляционных исследований.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем анализа клеточной и молекулярной динамики в процессе регенерации мышц.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней за счет идентификации активированных состояний стволовых клеток и клеток-предшественников с помощью мультиплексных маркеров.
- Способствует снижению механистических рисков, выявляя переходы между состояниями клеток и признаки дисфункции в моделях заболеваний.
- Повышает точность прогнозирования при отборе проектов в портфеле путем количественного определения редких популяций клеток и их статуса активации.
Скрининг и разработка анализа
- Подготавливает валидированные биологические системы для последующего скрининга путем выделения определенных популяций стволовых клеток и клеток-предшественников с помощью FACS.
- Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость анализа за счет количественных многомерных измерений белков с разрешением до одной клетки.
- Обеспечивает готовность к масштабируемому скринингу, позволяя одновременно анализировать до 50 маркеров в одной клетке.
- Предоставляет надежные количественные данные для оценки соединений в моделях, релевантных данным заболеваниям.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям заболеваний, обеспечивая возможность анализа динамики стволовых клеток и клеток-предшественников in vivo после повреждения или фармакологического воздействия.
- Способствует поиску трансляционных биомаркеров путем установления связи между молекулярными сигнатурами и результатами регенерации.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации, позволяя проводить функциональные исследования изолированных популяций клеток.
- Снижает риски при переходе к доклиническим исследованиям, предоставляя понимание механизмов дисфункции стволовых клеток при старении и заболеваниях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод охватывает все этапы: от раннего поиска до идентификации ведущих соединений и доклинических исследований, обеспечивая проверку гипотез, уточнение путей передачи сигналов и снижение биологических рисков в исследованиях регенерации мышц.
- Фундаментальная биология: Количественное профилирование стволовых клеток и клеток-предшественников позволяет прояснить регенеративные пути и механизмы принятия решений о судьбе клеток.
- Скрининг: Многомерный анализ маркеров обеспечивает готовность и воспроизводимость анализа для последующих приложений.
- Аналитика: Мультиплексное измерение белков и алгоритмы кластеризации позволяют проводить надежное сравнение клеточных состояний и условий.
- Трансляционные исследования: Применение in vivo на моделях заболеваний способствует согласованию биомаркеров и трансляционной преемственности.
- Корпоративное повторное использование: Платформа адаптируема для различных исследований регенерации и моделей заболеваний, что поддерживает широкое повторное использование в сфере НИОКР.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неоднозначность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированный, воспроизводимый и масштабируемый анализ отдельных клеток для редких популяций клеток.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), а также эффективно управлять портфелем проектов за счет количественной оценки динамики регенеративных клеток.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение программ регенеративной терапии и программ по модификации течения заболеваний.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт работы в области одноклеточной цитометрии, FACS и многомерного анализа данных.
- Необходим доступ к оборудованию для масс-цитометрии и передовой вычислительной инфраструктуре.
- Для обеспечения воспроизводимости требуется межгрупповая стандартизация панелей антител и стратегий гейтирования.
- Адаптация метода для различных моделей повреждения или заболеваний мышц может потребовать оптимизации панели маркеров.
- Пропускная способность и чувствительность ограничены возможностями прибора и обилием редких клеток.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:59
Induction of Acute Injury by Notexin Injection in the Mouse Skeletal Muscle
3:36
Dissection of the Mouse Skeletal Muscle After Notexin Injury and Cell Dissociation Procedure for Single‐Cell Analysis
5:17
Live/Dead Staining of Skeletal Muscle Cells,Isolated from Notexin‐Injured Mice,with Cisplatin and Paraformaldehyde Fixation
7:38
Skeletal Muscle Cells Preparation for Loading into Mass Cytometer and CyTOF Data Analysis
